Elegir el mejor búfer para su fase móvil HPLC: una guía
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¿Qué búfer es mejor para su fase móvil HPLC?

9 de septiembre de 2024
Seleccionar el búfer adecuado para su fase móvil HPLC es fundamental para lograr una separación y análisis óptimos de su muestras. Los amortiguadores ayudan a mantener un pH estable, que es esencial para controlar el estado de ionización de sus analitos, lo que afecta su tiempo de retención y su forma máxima. A continuación se muestra una descripción detallada de cómo seleccionar el mejor búfer para su aplicación HPLC.

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Importancia de la selección de amortiguación

Un tampón es una solución cuyo pH no cambia después de agregar una pequeña cantidad de ácido o base. Según su composición, los amortiguadores se pueden clasificar como ácidos o básicos. La efectividad de un tampón está determinada por su PKA, que idealmente debe estar dentro de la unidad de ± 1 pH del pH de la fase móvil deseada para una capacidad de amortiguación óptima.

Factores clave a considerar

1. Rango de PH: el pH de la fase móvil debe estar al menos a 2 unidades de pH de la PKA del analito. Esto ayuda a suprimir la ionización de analitos ácidos o básicos, maximizando su retención en la columna. Por ejemplo, si el analito es un ácido débil con un PKA de 4.5, usar una fase móvil con un pH alrededor de 2.0 lo mantendría en un estado no ionizado, mejorando la retención.

2. Tipo de buffer: los búferes comunes utilizados en HPLC incluyen:

Tampones de fosfato: efectivos en el rango de pH de 2.0 a 8.0, los tampones de fosfato se usan ampliamente debido a su estabilidad y compatibilidad con muchos analitos. Son particularmente adecuados para aplicaciones LC-UV.


Tampones de acetato: estos también son populares para los ensayos de LC-UV y pueden usarse en rangos de pH similares a los tampones de fosfato.

Buffers volátiles: para aplicaciones LC-MS, se prefieren los tampones volátiles como formato, acetato y bicarbonato de amonio porque se pueden eliminar fácilmente durante el proceso de espectrometría de masas.

3. Concentración de buffer: una concentración inicial típica para tampones en HPLC es de entre 25 y 50 mM. Las concentraciones más altas pueden mejorar la forma y la eficiencia máxima, pero también pueden conducir a la precipitación cuando se mezclan con solventes orgánicos. Es aconsejable mantener la concentración del amortiguador por debajo de 25 mM para evitar complicaciones.

4. Pureza química: use siempre tampones de grado cromatográfico de alta pureza para evitar la contaminación y garantizar resultados confiables. Las impurezas pueden conducir a interacciones inesperadas y variabilidad en los tiempos de retención.

Efectos de la temperatura: la temperatura puede influir en el pH de las soluciones de tampón. Es importante preparar y almacenar amortiguadores a una temperatura constante para mantener su efectividad.

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Consejos prácticos para la preparación del búfer

Método de preparación: los tampones se pueden preparar mezclando cantidades equimolares de sus componentes ácidos y básicos o titulando una solución básica con ácido. Evite ajustar el pH después de agregar solventes orgánicos, ya que esto puede conducir a resultados inconsistentes.

Soluciones frescas: prepare soluciones de tampón fresco regularmente para minimizar el crecimiento microbiano y la degradación de los componentes, lo que puede afectar el rendimiento cromatográfico.

Evitando la corrosión: ciertos tampones, como el citrato, pueden corroer los componentes de acero inoxidable de los sistemas HPLC. Asegúrese a un enjuague completo del sistema después de usar dichos tampones para evitar daños.

Conclusión

Seleccionar el búfer correcto para su fase móvil HPLC es fundamental para lograr resultados confiables y reproducibles. Considere el pH, el tipo de tampón, la concentración y la pureza al seleccionar. Al seguir estas pautas, puede optimizar su método HPLC para separar de manera efectiva y analizar sus muestras.

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