Tudo o que você precisa saber sobre a preparação da amostra HPLC

A preparação da amostra é uma etapa crítica na análise HPLC por vários motivos.

Minimizar interferências:As amostras geralmente contêm impurezas e componentes da matriz que podem interferir na detecção de analitos de destino. Técnicas eficazes de preparação de amostras podem ajudar a remover essas substâncias indesejadas e melhorar a precisão analítica.

Melhorar a recuperação do analito:A preparação adequada melhora a recuperação do analito e garante que os resultados reflitam a concentração real da amostra original. Isso é especialmente importante para a análise de rastreamento, onde os analitos estão presentes em baixas concentrações.

Forma de pico aprimorada:As amostras preparadas adequadamente ajudam a formar picos simétricos e bem definidos no cromatograma. Isso é essencial para quantificação precisa. A preparação inadequada da amostra pode resultar em pico de rejeição e ampliação, o que complica a interpretação dos dados.

Proteja seu sistema HPLC:Os contaminantes em sua amostra podem danificar as colunas e outros componentes no seu sistema HPLC, levando a um aumento nos custos de manutenção e no tempo de inatividade. A preparação adequada da amostra reduz o risco de entupimento e desgaste do sistema.

A primeira etapa na preparação da amostra é coletar sua amostra corretamente. Isso inclui:

Use recipientes limpos:Sempre use recipientes limpos e inertes para evitar a contaminação. Recomenda-se os recipientes plásticos de vidro ou de alta qualidade.

Evite contaminação:Use luvas e ferramentas limpas para impedir que a contaminação do sebo e outras fontes.

Rotulagem adequada:Rotule claramente amostras para evitar confusões e garantir a rastreabilidade.

A homogeneização da amostra garante a homogeneidade, o que é importante para resultados reproduzíveis. As técnicas de homogeneização incluem:

Homogenização mecânica: mistura de amostras sólidas ou semi-sólidas usando um agitador ou homogeneizador.

Homogenização ultrassônica:Aplicação do ultrassom em dispersar partículas dentro de uma amostra líquida.

Dependendo da concentração esperada de analitos, as amostras podem precisar ser diluídas ou concentradas. Isso pode ser alcançado por:

Diluição:Dilua a amostra na concentração desejada usando o mesmo solvente que a fase móvel.

Concentração:Os analitos podem ser concentrados usando técnicas como evaporação ou extração de fase sólida (SPE).

A filtração é essencial para remover matéria de partículas que podem obstruir as colunas HPLC. Os métodos de filtragem comuns incluem:

Filtração da membrana:UsarFiltros de 0,2 µm ou 0,45 µmpara remover partículas. Normalmente, são usados ​​filtros de poliethersulfona (PES) ou nylon.

Pré -filtração:Para amostras com alto teor de partículas, a pré -filtração através de um filtro de tamanho de poro maior pode impedir o entupimento.


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Considere estabilizar sua amostra para evitar a degradação do analito.

Ajuste do pH:Ajustar o pH pode ajudar a estabilizar certos analitos. Por exemplo, compostos ácidos podem exigir acidificação para evitar a degradação.

Aditivos:Adicionar estabilizadores ou conservantes pode ajudar a manter a integridade da amostra durante o armazenamento e análise.

É importante selecionar o solvente correto para dissolver sua amostra e garantir a compatibilidade com o seu sistema HPLC. Considere o seguinte:

Polaridade do solvente:Para alcançar a dissolução completa, o solvente deve corresponder à polaridade do analito.

Compatibilidade da fase móvel: Use um solvente compatível com a fase móvel para minimizar possíveis interferências.

7. Preparação de padrões

A preparação dos padrões de calibração é essencial para quantificar um analito em uma amostra. Isso inclui:

Preparação da curva de calibração:Prepare uma série de concentrações conhecidas do analito para estabelecer uma curva de calibração para quantificação.

Use o mesmo solvente:Para manter a consistência, sempre prepare seus padrões usando o mesmo solvente e condições que suas amostras.

Siga os procedimentos operacionais padrão (SOPS):Estabeleça e aderir aos POPs para a preparação da amostra para garantir consistência e reprodutibilidade.

Use reagentes e solventes de alta qualidade:Sempre use solventes de grau HPLC e reagentes de alta pureza para minimizar a contaminação.

Mantenha seu espaço de trabalho limpo:Mantenha a área de preparação da amostra limpa e organizada para reduzir o risco de contaminação.

Documente tudo:Mantenha registros detalhados de seus procedimentos de preparação de amostra, incluindo desvios de protocolos padrão.

Validar métodos:Valide regularmente os métodos de preparação de amostras para garantir que eles forneçam resultados confiáveis ​​e reproduzíveis.

Má Forma de Pico:Se os picos forem amplos ou de cauda, ​​isso pode indicar dissolução incompleta ou a presença de partículas. Verifique se sua amostra é completamente misturada e filtrada.

Ghost Peaks:Os picos de fantasmas podem ser causados ​​por impurezas no solvente ou amostra, use solventes de alta pureza e garantir que todos os copos e equipamentos estejam limpos.

Baixa sensibilidade:Se a sensibilidade for baixa, considere otimizar seu método de extração ou aumentar a concentração do seu analito.

Entupimento da coluna:O entupimento frequente pode indicar que sua amostra contém muitas partículas ou não está sendo filtrada adequadamente. Reavalie seu processo de filtragem e considere a pré-filtração.

Resultados inconsistentes:A variação nos resultados pode resultar da preparação inconsistente da amostra. Padronize todos os procedimentos e garanta que o pessoal envolvido na preparação da amostra seja devidamente treinado.

À medida que as demandas analíticas aumentam, os laboratórios estão adotando técnicas de preparação de amostras mais avançadas para melhorar a eficiência e a precisão:

O SPE é uma técnica amplamente usada que permite a extração seletiva de analitos de matrizes complexas. Envolve passar uma amostra líquida através de um sólido material adsorvente que retém o analito de destino, permitindo que as impurezas passem.

A LLE é uma técnica que separa os analitos com base em sua solubilidade em dois líquidos imiscíveis. Esse método é eficaz na separação de compostos com diferentes polaridades e é frequentemente usado na análise ambiental e farmacêutica.

Quechers é um método popular para preparar amostras alimentares e ambientais que combina as etapas de extração e limpeza em um processo, tornando-o eficiente e econômico.

A taxa de transferência e reprodutibilidade podem ser significativamente melhoradas por sistemas automatizados de preparação de amostras, que podem executar tarefas como diluição, filtração e SPE com uma intervenção humana mínima, reduzindo assim o risco de erros.


Deseja saber mais sobre a preparação da amostra do HPLC, verifique este artigo: Soluções de preparação de amostras de HPLC para obter melhores resultados

A preparação da amostra de HPLC é uma etapa crítica que pode afetar significativamente a precisão e a confiabilidade dos resultados analíticos. Seguindo as melhores práticas, usando técnicas apropriadas e abordando problemas comuns, os laboratórios podem otimizar o processo de preparação da amostra, adotando técnicas e tecnologias avançadas à medida que as necessidades analíticas evoluem. A automação melhorará ainda mais a eficiência e a eficácia das análises de HPLC. A preparação adequada da amostra não apenas melhora a qualidade dos resultados, mas também protege o sistema HPLC, garantindo confiabilidade e desempenho a longo prazo.