إتقان التدفق: دليل المحاربين القدامى في المختبر لمراحل HPLC المتنقلة

مقدمة

لقد كنت حيث أنت - أحدق في الشاشة في الساعة الثانية صباحًا، وأشاهد خطًا أساسيًا ينجرف مثل قارب ضائع في البحر، وأتساءل عما إذا كان "HPLC doo-hickey" قد تم اختراعه فقط لاختبار سلامة عقلي. إذا كنت تشعر بالهذيان وأنت تحاول الالتفاف حول تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC)، فخذ نفسًا. إنه ليس مجرد صندوق من الأجزاء باهظة الثمن؛ إنها رقصة دقيقة بين الكيمياء والفيزياء.

في المختبر، غالبًا ما نقول إن الطور المتحرك هو "خط الحياة" للنظام. بدونها، ستظل عينتك في الحاقن، ولن تذهب إلى أي مكان. ولكن كيف تختار "القطار" المناسب لنقل جزيئاتك إلى الكاشف؟ دعونا نقسمها كما لو كنا نتحدث أثناء تناول القهوة في غرفة الاستراحة.

1. ما هو HPLC حقًا؟

HPLC في جوهره يدور حول الانفصال. فكر في الأمر كسباق حيث "المسار" هو الطور الثابت (العمود) و"الريح" التي تدفع المتسابقين على طوله هي الطور المتحرك HPLC.

يحدث السحر لأن الجزيئات المختلفة لها "ارتباطات" مختلفة. بعض الجزيئات تحب الطور المتحرك وتتحرك عبر العمود. والبعض الآخر "لزج" - فهم معجبون بالمرحلة الثابتة ويتخلفون عن الركب. هذا الاختلاف في السرعة هو ما يخلق تلك القمم على اللوني الخاص بك.

2. المرحلة العادية مقابل المرحلة العكسية

هذا هو عادة المكان الذي يبدأ فيه الجميع في سحب شعرهم. خلال سنوات عملي، وجدت أن أسهل طريقة لتذكر ذلك هي النظر إلى القطبية.

أ. كروماتوغرافيا المرحلة العادية

هذه هي طريقة "المدرسة القديمة". في كروماتوغرافيا الطور العادي، يكون الطور الثابت قطبيًا، فكر فيه كمغناطيس للجزيئات القطبية. الطور المتحرك الذي نستخدمه هنا هو غير قطبي، وعادة ما يكون عبارة عن مذيبات مثل الهكسان أو الهيبتان.

• المنطق: يتم إعاقة الجزيئات القطبية "اللزجة" بواسطة العمود القطبي. تغسل الجزيئات غير القطبية بسرعة مع الطور المتحرك غير القطبي.

• نصيحة المحترفين: إذا قمت بزيادة قطبية الطور المتحرك لديك (بإضافة القليل من الأيزوبروبانول)، فسوف تتحرك عيناتك بشكل أسرع.

ب. كروماتوغرافيا الطور العكسي

واليوم، هذا هو المعيار الذهبي. ربما 90% من العمل الذي أقوم به في المختبر يتضمن كروماتوغرافيا الطور العكسي. هنا، نقوم بقلب السيناريو. العمود غير قطبي (كاره للماء، مثل الزيت)، والطور المتحرك قطبي (عادةً مزيج من الماء والميثانول أو الأسيتونيتريل).

• المنطق: الجزيئات (القطبية) المحبة للماء تتوسع لأنها تكره العمود الزيتي. تلتصق الجزيئات المحبة للدهون (غير القطبية) بالعمود مثل الغراء.

• لماذا نحبها: إنها قابلة للتنبؤ بها، ومتعددة الاستخدامات، وتستخدم المذيبات المائية التي يسهل إدارتها.

3. "القاعدة الذهبية" لجودة المذيبات

سترى "درجة HPLC" على الملصقات لسبب ما. لا تفكر حتى في استخدام درجة ACS أو أي شيء أقل من ذلك. لماذا؟ لأن تلك الشوائب "الصغيرة" الموجودة في المذيبات ذات الدرجة المنخفضة سوف تتراكم على عمودك بمرور الوقت، مما يؤدي إلى قتل الدقة وإنشاء قمم شبحية غريبة.

استخدم دائمًا مياه درجة Milli-Q (18.2 MΩ.cm). إذا كانت المياه "قذرة"، فسيبدو خط الأساس الخاص بك مثل سلسلة جبال، وسوف تقضي ثلاثة أيام في محاولة معرفة السبب.

4. تفريغ الغاز والترشيح: قتلة الأداء

الهواء هو عدو المرحلة المتنقلة HPLC. تحت الضغط العادي، يذوب الهواء في المذيبات. ولكن بمجرد وصول هذا المذيب إلى المضخة، يمكن أن تنحصر تلك الفقاعات الصغيرة في صمامات الفحص أو خلية الكاشف.

• النتيجة: تقلبات معدل التدفق، وخطوط الأساس النابضة، وأوقات الاستبقاء المتحركة.

• الحل: استخدم أجهزة إزالة الغازات المدمجة، أو الترشيح الفراغي إذا كنت تقوم بإجراء فحوصات عالية الحساسية.

التصفية ليست اختيارية. حتى المذيبات من فئة HPLC يمكن أن تحتوي على جزيئات مجهرية من عملية التصنيع أو غطاء الزجاجة. قم دائمًا بالتصفية من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر قبل أن يلمس الخزان الخاص بك. إنها مهمة مدتها 5 دقائق يمكنها إنقاذ عمودك من الموت المبكر.

5. المخازن المؤقتة والمصيدة الزجاجية

في كروماتوغرافيا الطور العكسي، نستخدم المحاليل المنظمة للحفاظ على ثبات الرقم الهيدروجيني للعينات القابلة للتأين.

• نصيحة احترافية: إذا كنت تستخدم محلولًا عازلًا اليوم، فاغسل النظام بالماء النقي/المزيج العضوي قبل العودة إلى المنزل. إذا لم تقم بذلك، فإن تلك الأملاح سوف تتبلور وتمزق أختام المضخة الخاصة بك.

• المصيدة الزجاجية: هل تعلم أنه إذا كان الرقم الهيدروجيني للطور المتحرك HPLC الخاص بك أكبر من 8.0، فيمكنه بالفعل ترشيح أيونات معدنية من الخزانات الزجاجية؟ قم بالتبديل إلى حاويات من الفولاذ المقاوم للصدأ أو حاويات بلاستيكية متخصصة في هذه الحالات.

دعنا نجعل انفصالك مثاليًا

يمثل الحصول على المرحلة المتنقلة بشكل صحيح 80% من المعركة في HPLC. إذا كنت تعاني من خطوط الأساس "السجادة الأشعث"، أو ارتفاع الضغط، أو النتائج غير المتسقة، فلا تضيع يومًا آخر في التخمين.

لقد أمضيت آلاف الساعات على مقاعد البدلاء في استكشاف هذه المشكلات بالتحديد وإصلاحها. يسعدني دائمًا مشاركة بعض النصائح "المثبتة معمليًا" لإعادة مشروعك إلى المسار الصحيح.

• واتساب: 86 18338832256

• البريد الإلكتروني:boonemi@aijirenvial.com
  

المراجع

• سنايدر، L. R.، كيركلاند، J. J.، ودولان، J. W. (2011). مقدمة في اللوني السائل الحديث. الطبعة الثالثة. جون وايلي وأولاده. ("المعيار الذهبي" لفهم آليات فصل HPLC).

• دولان، جي دبليو (2002). "التحضير للمرحلة المتنقلة." LCGC أمريكا الشمالية، سلسلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. (الدليل العملي الأساسي للتفريغ والترشيح).

• أباريسيو، ر. (محرر). (2013). دليل تحسين HPLC. إلسفير. (بيانات شاملة عن قطبية المذيبات واختيار المخزن المؤقت في كروماتوغرافيا الطور العكسي).

• تقنيات اجيلنت. "دليل استكشاف أخطاء نظام HPLC وإصلاحها: تجنب أخطاء الطور المحمول الشائعة." مكتبة الموارد التقنية.

• شركة المياه. "مبادئ اللوني: المرحلة العادية مقابل المرحلة العكسية." سلسلة التعليم.

• المؤتمر الدولي للتنسيق (ICH). السؤال الثاني (R1) التحقق من صحة الإجراءات التحليلية: النص والمنهجية. (معيار لتقدير منطقة الذروة واستقرار وقت الاحتفاظ).