Овладяване на потока: Ръководство за ветерани от лабораторията за HPLC мобилни фази

Въведение

Бил съм там, където сте вие ​​– взирайки се в монитора в 2 сутринта, наблюдавайки как базовата линия се носи като изгубена лодка в морето, чудейки се дали „HPLC doo-hickey“ е измислен само за да тества здравия ми разум. Ако се чувствате в делириум, опитвайки се да обгърнете високоефективната течна хроматография (HPLC), поемете дъх. Това не е просто кутия със скъпи части; това е деликатен танц между химия и физика.

В лабораторията често казваме, че мобилната фаза е "линията на живота" на системата. Без него вашата проба просто стои в инжектор и не отива никъде. Но как да изберете правилния "влак", за да пренесете вашите молекули до детектора? Нека да го разделим, сякаш разговаряме на кафе в стаята за почивка.

1. Какво всъщност е HPLC?

В основата си HPLC е разделяне. Мислете за това като за състезание, при което „пистата“ е стационарната фаза (колоната), а „вятърът“, който тласка бегачите е мобилната фаза на HPLC.

Магията се случва, защото различните молекули имат различни "афинитети". Някои молекули обичат подвижната фаза и увеличават мащаба през колоната. Други са "лепкави" - те са влюбени в стационарната фаза и изостават. Тази разлика в скоростта е това, което създава тези пикове на вашата хроматограма.

2. Нормална фаза срещу обратна фаза

Обикновено това е мястото, където всички започват да си скубят косите. В годините си на практика открих, че най-лесният начин да запомня това е като погледна полярността.

A. Хроматография с нормална фаза

Това е начинът от "старата школа". В нормалната фазова хроматография стационарната фаза е полярна – мислете за нея като за магнит за полярни молекули. Подвижната фаза, която използваме тук, е неполярна, обикновено разтворители като хексан или хептан.

• Логиката: Полярните "лепкави" молекули се задържат от полярната колона. Неполярните молекули се измиват бързо с неполярната подвижна фаза.

• Професионалният съвет: Ако увеличите полярността на подвижната си фаза (като добавите малко изопропанол), вашите проби всъщност ще се движат по-бързо.

Б. Хроматография с обърната фаза

Днес това е златният стандарт. Вероятно 90% от работата, която върша в лабораторията, включва обратнофазова хроматография. Тук обръщаме сценария. Колоната е неполярна (хидрофобна, като масло), а подвижната фаза е полярна (обикновено смес от вода и метанол или ацетонитрил).

• Логиката: Водолюбивите (полярни) молекули се приближават, защото мразят мазната колона. Мазнолюбивите (неполярни) молекули се придържат към колоната като лепило.

• Защо го харесваме: Той е предвидим, гъвкав и използва разтворители на водна основа, които са по-лесни за управление.

3. "Златното правило" за качеството на разтворителя

Ще видите „HPLC Grade“ на етикетите с причина. Дори не си помисляйте да използвате клас ACS или нещо по-малко. защо Тъй като тези „малки“ примеси в нискокачествени разтворители ще се натрупат във вашата колона с течение на времето, убивайки разделителната способност и създавайки странни призрачни пикове.

Винаги използвайте вода с клас Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Ако водата ви е „мръсна“, изходната ви линия ще изглежда като планинска верига и ще прекарате три дни, опитвайки се да разберете защо.

4. Дегазиране и филтриране: убийците на производителността

Въздухът е врагът на HPLC мобилната фаза. При нормално налягане въздухът се разтваря във вашите разтворители. Но след като разтворителят попадне в помпата, тези малки мехурчета могат да се хванат в контролните клапани или клетката на детектора.

• Резултатът: Флуктуации на дебита, пулсиращи базови линии и движещи се времена на задържане.

• Решението: Използвайте вградени дегазатори или ултразвук\/вакуумно филтриране, ако провеждате анализи с висока чувствителност.

Филтрирането не е задължително. Дори разтворителите с клас HPLC могат да имат микроскопични частици от производствения процес или от капачката на бутилката. Винаги филтрирайте през мембрана от 0,22 µm или 0,45 µm, преди да докосне вашия резервоар. Това е 5-минутна задача, която може да спаси вашата колона от преждевременна смърт.

5. Буфери и стъклен капан

При обратнофазовата хроматография използваме буфери, за да поддържаме pH стабилно за йонизиращите се проби.

• Професионален съвет: Ако днес сте използвали буфер, измийте системата с чиста вода\/органична смес, преди да се приберете вкъщи. Ако не го направите, тези соли ще кристализират и ще накъсат уплътненията на вашата помпа.

• Стъкленият капан: Знаете ли, че ако рН на вашата HPLC мобилна фаза е > 8,0, тя всъщност може да отдели метални йони от стъклени резервоари? В тези случаи преминете към контейнери от неръждаема стомана или специализирани пластмасови контейнери.

Нека раздялата ви бъде перфектна

Получаването на правилната мобилна фаза е 80% от битката при HPLC. Ако се борите с изходните линии на "мохран килим", пикове на налягането или непоследователни резултати, не губете нито един ден в гадания.

Прекарах хиляди часове на работната скамейка в отстраняване на точно тези проблеми. Винаги се радвам да споделя малко "лабораторно доказани" съвети, за да върнете проекта си в релси.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Имейл:boonemi@aijirenvial.com
  

Референции

• Снайдер, Л. Р., Къркланд, Дж. Дж. и Долан, Дж. У. (2011). Въведение в съвременната течна хроматография. 3-то издание. Джон Уайли и синове. („Златният стандарт“ за разбиране на механизмите за HPLC разделяне).

• Долан, Дж. У. (2002). "Подготовка на мобилната фаза." LCGC Северна Америка, Серия за отстраняване на неизправности. (Основно практическо ръководство за дегазиране и филтриране).

• Апарисио, Р. (Ред.). (2013). Ръководство за HPLC оптимизация. Elsevier. (Изчерпателни данни за полярността на разтворителя и избора на буфер при обратнофазова хроматография).

• Agilent Technologies. „Ръководство за отстраняване на неизправности в системата за HPLC: Избягване на често срещани грешки на мобилната фаза.“ Библиотека с технически ресурси.

• Уотърс Корпорейшън. „Принципи на хроматографията: нормална фаза срещу обратна фаза.“ Поредица за образование.

• Международна конференция по хармонизация (ICH). Q2(R1) Валидиране на аналитични процедури: текст и методология. (Стандарт за количествено определяне на площта на пика и стабилност на времето на задържане).