Sveobuhvatni vodič za prethodnu obradu HPLC uzoraka – filtriranje, ekstrakcija i derivatizacija
Dom
Vijesti
Dom > Faq
kategorije
UPIT

Predtretman HPLC uzorka – vodič korak po korak

21. oktobar 2025
OZNAKE:

Pregled predtretmana uzorka

Predtretman uzorka uključuje sve operacije prije ubrizgavanja. Osim vaganja, rastvaranja i razrjeđivanja, uključuje i sljedeće korake:

  • Filtracija
  • Ekstrakcija
  • Derivatizacija (prekolonska derivatizacija)
  • Tekuća hromatografija (kromatografija na koloni niskog pritiska)

Predtretman se može izvesti ručno ili automatizirano. Jeste li upoznati sa predobradom uzorka?


Derivatizacija

Neki uzorci se još uvijek ne mogu direktno ubrizgati nakon prethodnog tretmana. Derivatizacija je potrebna da bi se napravila jedinjenja bez UV apsorpcije ili fluorescencije koju detektuju UV ili fluorescentni detektori.

  • Poboljšava osjetljivost
  • Poboljšava razdvajanje (promjena kvaliteta)

Mogući problemi uključuju gubitak uzorka, kontaminaciju, nepotpune reakcije ili više nusproizvoda, što može utjecati na točnost ili unijeti greške.

Filtracija uzorka

LC uzorci moraju biti ujednačeni i bez čestica; čestice mogu oštetiti injektor ili blokirati kolonu. Koraci uključuju:

  • Protresite uzorak prije ubrizgavanja i provjerite ima li čestica, zamućenosti ili emulzija
  • Ako se uoče čestice, filtrirajte uzorak pomoću membrane koja može zadržati ≥0,15 μm čestica

Potencijalni problemi: kontaminacija uzorka, koncentracija komponenti koja smanjuje adsorpciju i isparavanje rastvarača koje uzrokuje greške.

Metode ekstrakcije

Ekstrakcijom se odvajaju analiti od ko-otapala ili uklanjaju ometajuće supstance (npr. proteini). Organski rastvarači trebaju biti niske toksičnosti, isparljivi, sa malo nečistoća i dobro rastvarati uzorak.

Uobičajeni rastvarači: dietil etar, etil acetat, dihlorometan, hloroform, benzen ili smeše.

Nakon ekstrakcije, uzorci se mogu direktno ubrizgati ili koncentrirati kako bi se povećala koncentracija i osjetljivost analita.

Ekstrakcija uzorka rastvorljivog u vodi

  1. Kisele komponente i soli: ekstrahirati nečistoće organskim rastvaračem, podesiti na kiselo, zatim ekstrahirati ili ubrizgati; ili osušiti pod N₂ i rastvoriti u odgovarajućem rastvaraču prije ubrizgavanja.
  2. Osnovne komponente i soli: ekstrahirati nečistoće organskim rastvaračem, prilagoditi na bazično, zatim ekstrahirati ili ubrizgati; ili osušiti pod N₂ i rastvoriti u odgovarajućem rastvaraču prije ubrizgavanja.
  3. Neutralne komponente: ekstrahirajte nečistoće organskim rastvaračem, zatim analizirajte direktno hromatografijom reverzne faze.


Ekstrakcija uzoraka rastvorljivih u mastima

Ekstrahovati organskim rastvaračem ili direktno ubrizgati; ili osušiti pod N₂ i rastvoriti u odgovarajućem rastvaraču prije ubrizgavanja.


Izvori kontaminacije

Potencijalni izvori kontaminacije u analizi:

Vrsta kontaminacije

Izvor

Mere prevencije

Environmental

Štetni gasovi, prašina, aerosoli

Održavajte sobu sa instrumentima izoliranom, čistom; instalirati AC; kontrola vlažnosti <70%; sprječavaju vlagu, koroziju, vibracije

Kontejneri

Laboratorijski pribor od stakla, keramike, kvarca, plastike

Odaberite odgovarajuće posude po vrsti uzorka; temeljito očistiti

Reagensi

Reagensi koji nisu hromatografski

Koristite reagense hromatografskog kvaliteta, visoke čistoće ili analitičkog kvaliteta


Standardna priprema rastvora

  • Prvo pripremite rastvor internog standarda; koristite istu seriju u standardima i uzorcima kako biste smanjili greške
  • Supstance moraju biti hromatografske i stabilne
  • Čuvati standardne otopine u smeđim bocama na niskoj temperaturi
  • Za vitamine koristite smeđe volumetrijske tikvice ili ih zaštitite od svjetlosti


Uobičajeni problemi u prethodnoj obradi uzorka i rješenja

Problem

Uzrok

Rješenje

Nepovezani vrhovi u hromatogramu

Kontaminacija filtera

  1. Potopite filter u rastvarač uzorka i testirajte injekciju

  2. Promijenite vrstu filtera

  3. Koristite alternativne tehnike čišćenja

Nizak vršni odziv (posebno uzorci niske koncentracije)

Adsorpcija na površini filtera

  1. Promijenite vrstu filtera

  2. Obradite sve uzorke pod istim uslovima

  3. Koristite alternativne tehnike čišćenja

Nizak oporavak

Nepotpuna ekstrakcija

  1. Povećajte vrijeme ekstrakcije, koristite vrući rastvarač

  2. Podesite način čišćenja

Prošireni vrhovi, skraćeni vijek trajanja kolone

Interferencija i kontaminacija uzorka

Poboljšajte način čišćenja

Loša preciznost

Nepotpuni oporavak

  1. Optimizirajte ili zamijenite derivatizaciju, odvajanje, ekstrakciju ili druge uvjete

  2. Koristite automatizovano rukovanje da poboljšate preciznost

Upit