Dominar el flux: una guia per a veterans de laboratori per a les fases mòbils d'HPLC

Introducció

He estat on ets: mirant un monitor a les 2 del matí, observant una línia de base deriva com un vaixell perdut al mar, preguntant-me si el "HPLC doo-hickey" es va inventar només per posar a prova el meu cor. Si tens un delir intentant embolicar el teu cap amb la cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC), respira. No és només una caixa de peces cares; és un ball delicat entre la química i la física.

Al laboratori, sovint diem que la fase mòbil és la "línia de vida" del sistema. Sense ell, la vostra mostra està asseguda en un injector, sense anar enlloc. Però, com escolliu el "tren" adequat per portar les vostres molècules al detector? Desglossem-ho com si estiguéssim xerrant prenent un cafè a la sala de descans.

1. Què és l'HPLC, realment?

En el seu nucli, l'HPLC tracta de la separació. Penseu-hi com una cursa on la "pista" és la fase estacionària (la columna) i el "vent" que empeny els corredors és la fase mòbil hplc.

La màgia passa perquè diferents molècules tenen diferents "afinitats". Algunes molècules estimen la fase mòbil i fan zoom per la columna. Altres són "enganxosos": estan enamorats de la fase estacionària i es queden enrere. Aquesta diferència de velocitat és el que crea aquests pics al cromatograma.

2. Fase normal vs. Fase inversa

Normalment és aquí on tothom comença a estirar-se els cabells. Durant els meus anys de pràctica, he trobat la manera més fàcil de recordar-ho és mirant la polaritat.

A. Cromatografia de fase normal

Aquesta és la manera de la "vella escola". En la cromatografia de fase normal, la fase estacionària és polar; penseu-hi com un imant per a molècules polars. La fase mòbil que fem servir aquí és no polar, normalment dissolvents com l'hexà o l'heptà.

• La lògica: les molècules polars "enganxoses" són restringides per la columna polar. Les molècules no polars es renten ràpidament amb la fase mòbil no polar.

• El consell professional: si augmenteu la polaritat de la vostra fase mòbil (afegiu una mica d'isopropanol), les vostres mostres es mouran més ràpidament.

B. Cromatografia en fase inversa

Avui, aquest és el patró or. Probablement el 90% del treball que faig al laboratori implica cromatografia en fase inversa. Aquí, donem la volta al guió. La columna és no polar (hidrofòbica, com el petroli), i la fase mòbil és polar (normalment una barreja d'aigua i metanol o acetonitril).

• La lògica: les molècules (polars) amants de l'aigua fan zoom perquè odien la columna greixosa. Les molècules amants del greix (no polars) s'enganxen a la columna com una cola.

• Per què ens encanta: és previsible, versàtil i utilitza dissolvents a base d'aigua que són més fàcils de gestionar.

3. La "regla d'or" de la qualitat del dissolvent

Veureu "Grau HPLC" a les etiquetes per un motiu. Ni tan sols penseu a utilitzar el grau ACS o res menys. Per què? Com que aquestes "petites" impureses en dissolvents de grau inferior s'acumularan a la teva columna amb el pas del temps, matant la teva resolució i creant pics fantasma estranys.

Feu servir sempre aigua de grau Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Si la vostra aigua està "bruta", la vostra línia de base semblarà una serralada i passareu tres dies intentant esbrinar per què.

4. Desgasificació i filtració: The Performance Killers

L'aire és l'enemic de la fase mòbil de HPLC. A pressió normal, l'aire es dissol en els dissolvents. Però un cop aquest dissolvent arriba a la bomba, aquestes petites bombolles poden quedar atrapades a les vàlvules de retenció o a la cèl·lula del detector.

• El resultat: fluctuacions del cabal, línies de base intermitents i temps de retenció en moviment.

• La solució: utilitzeu desgasificadors integrats o filtració al buit per sonicació si feu assajos d'alta sensibilitat.

La filtració no és opcional. Fins i tot els dissolvents de grau HPLC poden tenir partícules microscòpiques del procés de fabricació o del tap de l'ampolla. Filtreu sempre a través d'una membrana de 0,22 µm o 0,45 µm abans que toqui el vostre dipòsit. És una tasca de 5 minuts que pot salvar la teva columna d'una mort prematura.

5. Els tampons i la trampa de vidre

En la cromatografia en fase inversa, utilitzem tampons per mantenir el pH estable per a mostres ionitzables.

• Consell professional: si heu utilitzat un tampó avui, renteu el sistema amb aigua pura\/mescla orgànica abans de tornar a casa. Si no ho fas, aquestes sals cristal·litzaran i trituraran els segells de la bomba.

• La trampa de vidre: sabíeu que si el pH de la vostra fase mòbil de HPLC és > 8,0, en realitat pot filtrar ions metàl·lics dels dipòsits de vidre? En aquests casos, canvieu a recipients d'acer inoxidable o plàstic especialitzats.

Fem que la vostra separació sigui perfecta

Aconseguir la fase mòbil correcta és el 80% de la batalla en HPLC. Si teniu problemes amb les línies de base de la "catifa pelusa", els pics de pressió o els resultats inconsistents, no perdeu un dia més en endevinar.

He passat milers d'hores al banc resolent aquests problemes exactes. Sempre estic encantat de compartir una mica de consells "provats en laboratori" per recuperar el vostre projecte.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Correu electrònic:boonemi@aijirenvial.com
  

Referències

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. i Dolan, J. W. (2011). Introducció a la cromatografia líquida moderna. 3a Edició. John Wiley & Sons. (El "Gold Standard" per entendre els mecanismes de separació HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Preparació de la fase mòbil". LCGC Amèrica del Nord, sèrie de resolució de problemes. (Guia pràctica essencial per a la desgasificació i filtració).

• Aparicio, R. (Ed.). (2013). Manual d'optimització per HPLC. Elsevier. (Dades exhaustives sobre la polaritat del dissolvent i la selecció del tampó en cromatografia en fase inversa).

• Tecnologies Agilent. "Guia de resolució de problemes del sistema HPLC: evitant errors comuns de fase mòbil". Biblioteca de recursos tècnics.

• Corporació Aigües. "Principis de cromatografia: fase normal vs fase inversa". Sèrie d'Educació.

• Conferència Internacional sobre Harmonització (ICH). Q2(R1) Validació de procediments analítics: text i metodologia. (Estàndard per a la quantificació de l'àrea màxima i l'estabilitat del temps de retenció).