Rhagymadrodd
Rydw i wedi bod lle rydych chi - yn syllu ar fonitor am 2 AM, yn gwylio drifft gwaelodlin fel cwch coll ar y môr, yn meddwl tybed a gafodd yr "HPLC doo-hickey" ei ddyfeisio dim ond i brofi fy bwyll. Os ydych chi'n teimlo'n wallgof yn ceisio lapio'ch pen o amgylch cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC), cymerwch anadl. Nid blwch o rannau drud yn unig mohono; mae'n ddawns ysgafn rhwng cemeg a ffiseg.
Yn y labordy, rydym yn aml yn dweud mai'r cyfnod symudol yw "llinell bywyd" y system. Hebddo, dim ond eistedd mewn chwistrellwr yw eich sampl, heb fynd i unman. Ond sut ydych chi'n dewis y "trên" iawn i gario'ch moleciwlau i'r synhwyrydd? Gadewch i ni ei dorri i lawr fel ein bod ni'n sgwrsio dros goffi yn yr ystafell dorri.
1. Beth yw HPLC, Mewn gwirionedd?
Yn greiddiol iddo, mae HPLC yn ymwneud â gwahanu. Meddyliwch amdano fel ras lle mae'r "trac" yn gyfnod llonydd (y golofn) a'r "gwynt" sy'n gwthio'r rhedwyr ymlaen yw'r cyfnod symudol hplc.
Mae'r hud yn digwydd oherwydd bod gan wahanol foleciwlau "affinedd" gwahanol. Mae rhai moleciwlau wrth eu bodd â'r cyfnod symudol ac yn chwyddo drwy'r golofn. Mae eraill yn "ludiog" - mae ganddyn nhw wasgfa ar y cyfnod llonydd ac ar ei hôl hi. Y gwahaniaeth hwn mewn cyflymder sy'n creu'r brigau hynny ar eich cromatogram.
2. Cyfnod Arferol vs Cyfnod Gwrthdroi
Fel arfer dyma lle mae pawb yn dechrau tynnu eu gwallt allan. Yn fy mlynyddoedd o ymarfer, rwyf wedi dod o hyd i'r ffordd hawsaf o gofio hyn yw trwy edrych ar bolaredd.
A. Cromatograffeg y Cyfnod Normal
Dyma'r ffordd "hen ysgol". Mewn cromatograffaeth cyfnod arferol, mae'r cyfnod llonydd yn begynol - meddyliwch amdano fel magnet ar gyfer moleciwlau pegynol. Nid yw'r cyfnod symudol a ddefnyddiwn yma yn begynol, fel arfer toddyddion fel hecsan neu heptane.
-
Y Rhesymeg: Mae moleciwlau "gludiog" pegynol yn cael eu dal yn ôl gan y golofn begynol. Mae moleciwlau nad ydynt yn begynol yn golchi allan yn gyflym gyda'r cyfnod symudol nad yw'n begynol.
-
Y Cyngor Pro: Os byddwch chi'n cynyddu polaredd eich cyfnod symudol (gan ychwanegu ychydig o isopropanol), bydd eich samplau'n symud yn gyflymach mewn gwirionedd.
B. Cromatograffaeth Cyfnod Gwrthdro
Heddiw, dyma'r safon aur. Mae'n debyg bod 90% o'r gwaith rwy'n ei wneud yn y labordy yn ymwneud â chromatograffaeth cam cefn. Yma, rydyn ni'n troi'r sgript. Nid yw'r golofn yn begynol (hydroffobig, fel olew), ac mae'r cam symudol yn begynol (cymysgedd o ddŵr a methanol neu asetonitrile fel arfer).
-
Y Rhesymeg: Mae moleciwlau sy'n caru dŵr (pegynol) yn chwyddo trwodd oherwydd eu bod yn casáu'r golofn olewog. Mae moleciwlau sy'n caru braster (nad ydynt yn begynol) yn glynu wrth y golofn fel glud.
-
Pam rydyn ni'n ei garu: Mae'n rhagweladwy, yn amlbwrpas, ac yn defnyddio toddyddion dŵr sy'n haws eu rheoli.
3. Y "Rheol Aur" o Ansawdd Toddyddion
Fe welwch "Gradd HPLC" ar labeli am reswm. Peidiwch â meddwl am ddefnyddio gradd ACS neu unrhyw beth llai hyd yn oed. Pam? Oherwydd bydd yr amhureddau "bach" hynny mewn toddyddion gradd is yn cronni ar eich colofn dros amser, gan ladd eich datrysiad a chreu copa ysbryd rhyfedd.
Defnyddiwch ddŵr gradd Milli-Q (18.2 MΩ.cm) bob amser. Os yw'ch dŵr yn "fudr," bydd eich llinell sylfaen yn edrych fel cadwyn o fynyddoedd, a byddwch yn treulio tri diwrnod yn ceisio darganfod pam.
4. Degassing a Hidlo: Y Killers Perfformiad
Awyr yw gelyn y cyfnod symudol hplc. O dan bwysau arferol, mae aer yn hydoddi yn eich toddyddion. Ond unwaith y bydd y toddydd hwnnw'n taro'r pwmp, gall y swigod bach hynny gael eu dal yn y falfiau gwirio neu'r gell canfod.
-
Y Canlyniad: Amrywiadau cyfradd llif, curiad y gwaelodlinau, ac amseroedd cadw symudol.
-
Y Atgyweiria: Defnyddiwch adeiledig yn degassers, neu sonication \ / / hidlo gwactod os ydych yn rhedeg uchel-sensitifrwydd profion.
Nid yw hidlo'n Ddewisol. Gall hyd yn oed toddyddion gradd HPLC gael gronynnau microsgopig o'r broses weithgynhyrchu neu'r cap potel. Hidlwch drwy bilen 0.22µm neu 0.45µm bob amser cyn iddi gyffwrdd â’ch cronfa ddŵr. Mae'n dasg 5 munud a all arbed eich colofn rhag marwolaeth gynamserol.
5. Byfferau a'r Trap Gwydr
Mewn cromatograffaeth cam cefn, rydym yn defnyddio byfferau i gadw pH yn sefydlog ar gyfer samplau ïonadwy.
-
Cyngor Pro: Os gwnaethoch ddefnyddio byffer heddiw, golchwch y system â dŵr pur \/ cymysgedd organig cyn i chi fynd adref. Os na wnewch chi, bydd yr halwynau hynny'n crisialu ac yn rhwygo'ch morloi pwmp.
-
Y Trap Gwydr: Oeddech chi'n gwybod os yw eich pH cyfnod symudol hplc yn > 8.0, y gall mewn gwirionedd drwytholchi ïonau metel o gronfeydd gwydr? Newid i ddur di-staen neu gynwysyddion plastig arbenigol yn yr achosion hyn.
Dewch i ni Gael Eich Gwahaniad Perffaith
Cael y cyfnod symudol yn iawn yw 80% o'r frwydr yn HPLC. Os ydych chi'n cael trafferth gyda llinellau sylfaen "carped shag", pigau pwysau, neu ganlyniadau anghyson, peidiwch â gwastraffu diwrnod arall yn dyfalu.
Rwyf wedi treulio miloedd o oriau wrth y fainc yn datrys yr union faterion hyn. Rwyf bob amser yn hapus i rannu ychydig o gyngor "profedig mewn labordy" i gael eich prosiect yn ôl ar y trywydd iawn.
Cyfeiriadau
-
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Cyflwyniad i Gromatograffaeth Hylif Fodern. 3ydd Argraffiad. John Wiley a'i Feibion. (Y "Safon Aur" ar gyfer deall mecanweithiau gwahanu HPLC).
-
Dolan, J. W. (2002). msgstr "Paratoi Cyfnod Symudol." LCGC Gogledd America, Cyfres Datrys Problemau. (Canllaw ymarferol hanfodol ar gyfer dadnwyo a hidlo).
-
Aparicio, R. (gol.). (2013). Llawlyfr Optimeiddio HPLC. Elsevier. (Data cynhwysfawr ar bolaredd toddyddion a dewis byffer mewn cromatograffaeth cam cefn).
-
Technolegau Agilent. msgstr "Canllaw Datrys Problemau System HPLC: Osgoi Gwallau Cam Symudol Cyffredin." Llyfrgell Adnoddau Technegol.
-
Corfforaeth Dyfroedd. "Egwyddorion Cromatograffaeth: Cyfnod Normal vs. Cyfnod Gwrthdroi." Cyfres Addysg.
-
Cynhadledd Ryngwladol ar Gysoni (ICH). C2(R1) Dilysu Gweithdrefnau Dadansoddol: Testun a Methodoleg. (Safon ar gyfer meintioli ardal brig a sefydlogrwydd amser cadw).
Saesneg
Tsieineaidd
