Εισαγωγή
Ήμουν εκεί που βρίσκεστε—κοιτάζοντας μια οθόνη στις 2 τα ξημερώματα, παρακολουθώντας μια γραμμή βάσης να παρασύρεται σαν χαμένη βάρκα στη θάλασσα, αναρωτιέμαι αν το "HPLC doo-hickey" εφευρέθηκε μόνο για να δοκιμάσει τη λογική μου. Εάν αισθάνεστε παραληρημένοι προσπαθώντας να τυλίξετε το κεφάλι σας γύρω από υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), πάρτε μια ανάσα. Δεν είναι απλώς ένα κουτί με ακριβά ανταλλακτικά. είναι ένας λεπτός χορός μεταξύ χημείας και φυσικής.
Στο εργαστήριο, λέμε συχνά ότι η κινητή φάση είναι η «γραμμή ζωής» του συστήματος. Χωρίς αυτό, το δείγμα σας βρίσκεται απλώς σε έναν εγχυτήρα, χωρίς να πηγαίνει πουθενά. Πώς όμως επιλέγετε το κατάλληλο «τρένο» για να μεταφέρετε τα μόριά σας στον ανιχνευτή; Ας το αναλύσουμε σαν να κουβεντιάζουμε για έναν καφέ στην αίθουσα.
1. Τι είναι το HPLC, αλήθεια;
Στον πυρήνα της, η HPLC αφορά τον διαχωρισμό. Σκεφτείτε το σαν έναν αγώνα όπου η "πίστα" είναι η στατική φάση (η στήλη) και ο "άνεμος" που σπρώχνει τους δρομείς κατά μήκος είναι η κινητή φάση hplc.
Η μαγεία συμβαίνει επειδή διαφορετικά μόρια έχουν διαφορετικές «συγγένειες». Ορισμένα μόρια αγαπούν την κινητή φάση και μεγεθύνουν τη στήλη. Άλλοι είναι «κολλώδεις» — έχουν κολλήσει στη στατική φάση και υστερούν. Αυτή η διαφορά στην ταχύτητα είναι που δημιουργεί αυτές τις κορυφές στο χρωματογράφημά σας.
2. Κανονική φάση έναντι αντίστροφης φάσης
Αυτό είναι συνήθως όπου όλοι αρχίζουν να τραβούν τα μαλλιά τους. Στα χρόνια της πρακτικής μου, βρήκα τον ευκολότερο τρόπο να το θυμάμαι αυτό είναι κοιτάζοντας την πολικότητα.
Α. Χρωματογραφία κανονικής φάσης
Αυτός είναι ο τρόπος «παλιάς σχολής». Στη χρωματογραφία κανονικής φάσης, η στατική φάση είναι πολική — σκεφτείτε το σαν μαγνήτης για πολικά μόρια. Η κινητή φάση που χρησιμοποιούμε εδώ είναι μη πολική, συνήθως διαλύτες όπως εξάνιο ή επτάνιο.
-
Η Λογική: Τα πολικά «κολλώδη» μόρια συγκρατούνται από την πολική στήλη. Τα μη πολικά μόρια ξεπλένονται γρήγορα με τη μη πολική κινητή φάση.
-
Η επαγγελματική συμβουλή: Εάν αυξήσετε την πολικότητα της κινητής φάσης σας (προσθέτοντας λίγη ισοπροπανόλη), τα δείγματά σας θα κινηθούν πραγματικά πιο γρήγορα.
Β. Χρωματογραφία ανάστροφης φάσης
Σήμερα, αυτός είναι ο κανόνας του χρυσού. Πιθανώς το 90% της εργασίας που κάνω στο εργαστήριο περιλαμβάνει χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Εδώ, αναποδογυρίζουμε το σενάριο. Η στήλη είναι μη πολική (υδρόφοβη, όπως το λάδι), και η κινητή φάση είναι πολική (συνήθως ένα μείγμα νερού και μεθανόλης ή ακετονιτριλίου).
-
Η λογική: Τα μόρια που αγαπούν το νερό (πολικά) μεγεθύνονται επειδή μισούν την ελαιώδη στήλη. Τα λίπος (μη πολικά) μόρια κολλάνε στη στήλη σαν κόλλα.
-
Γιατί το λατρεύουμε: Είναι προβλέψιμο, ευέλικτο και χρησιμοποιεί διαλύτες με βάση το νερό που είναι πιο εύκολο να διαχειρίζονται.
3. Ο «Χρυσός Κανόνας» Ποιότητας Διαλυτών
Θα δείτε το "HPLC Grade" στις ετικέτες για κάποιο λόγο. Μην σκέφτεστε καν να χρησιμοποιήσετε το βαθμό ACS ή κάτι λιγότερο. Γιατί; Επειδή αυτές οι «μικροσκοπικές» ακαθαρσίες σε διαλύτες χαμηλότερης ποιότητας θα συσσωρευτούν στη στήλη σας με την πάροδο του χρόνου, σκοτώνοντας την ανάλυσή σας και δημιουργώντας περίεργες κορυφές φαντασμάτων.
Χρησιμοποιείτε πάντα νερό ποιότητας Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Εάν το νερό σας είναι "βρώμικο", η γραμμή βάσης σας θα μοιάζει με οροσειρά και θα περάσετε τρεις ημέρες προσπαθώντας να καταλάβετε γιατί.
4. Απαέρωση και φιλτράρισμα: The Performance Killers
Ο αέρας είναι ο εχθρός της κινητής φάσης hplc. Υπό κανονική πίεση, ο αέρας διαλύεται στους διαλύτες σας. Αλλά μόλις αυτός ο διαλύτης χτυπήσει την αντλία, αυτές οι μικροσκοπικές φυσαλίδες μπορούν να παγιδευτούν στις βαλβίδες αντεπιστροφής ή στην κυψέλη του ανιχνευτή.
-
Το αποτέλεσμα: Διακυμάνσεις του ρυθμού ροής, παλμικές γραμμές βάσης και κινούμενοι χρόνοι συγκράτησης.
-
Η επιδιόρθωση: Χρησιμοποιήστε ενσωματωμένους απαερωτές ή υπερήχους\/φιλτράρισμα κενού εάν εκτελείτε δοκιμές υψηλής ευαισθησίας.
Το φιλτράρισμα δεν είναι προαιρετικό. Ακόμη και οι διαλύτες ποιότητας HPLC μπορούν να έχουν μικροσκοπικά σωματίδια από τη διαδικασία παραγωγής ή το καπάκι της φιάλης. Πάντα να φιλτράρετε μέσα από μια μεμβράνη 0,22 μm ή 0,45 μm προτού αγγίξει τη δεξαμενή σας. Είναι μια εργασία 5 λεπτών που μπορεί να σώσει τη στήλη σας από έναν πρόωρο θάνατο.
5. Buffers και η γυάλινη παγίδα
Στη χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, χρησιμοποιούμε ρυθμιστικά διαλύματα για να διατηρήσουμε σταθερό το pH για ιονίσιμα δείγματα.
-
Επαγγελματική συμβουλή: Εάν χρησιμοποιήσατε buffer σήμερα, πλύνετε το σύστημα με καθαρό νερό\/οργανικό μείγμα πριν πάτε σπίτι. Εάν δεν το κάνετε, αυτά τα άλατα θα κρυσταλλωθούν και θα θρυμματίσουν τις τσιμούχες της αντλίας σας.
-
Η Γυάλινη Παγίδα: Γνωρίζατε ότι εάν το pH της κινητής φάσης του hplc είναι > 8,0, μπορεί πραγματικά να εκπλύνει μεταλλικά ιόντα από γυάλινες δεξαμενές; Αλλάξτε σε ανοξείδωτα ή εξειδικευμένα πλαστικά δοχεία σε αυτές τις περιπτώσεις.
Ας κάνουμε τον χωρισμό σας τέλειο
Η σωστή λήψη της κινητής φάσης είναι το 80% της μάχης στο HPLC. Αν παλεύετε με τις βασικές γραμμές "χαλί σκαρώνας", τις αιχμές πίεσης ή τα ασυνεπή αποτελέσματα, μην χάνετε άλλη μια μέρα μαντεύοντας.
Έχω περάσει χιλιάδες ώρες στον πάγκο για να αντιμετωπίσω αυτά τα προβλήματα. Είμαι πάντα στην ευχάριστη θέση να μοιραστώ μερικές «αποδεδειγμένες σε εργαστήριο» συμβουλές για να επαναφέρετε το έργο σας σε καλό δρόμο.
Αναφορές
-
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Εισαγωγή στη Σύγχρονη Υγρή Χρωματογραφία. 3η Έκδοση. John Wiley & Sons. (Το "Gold Standard" για την κατανόηση των μηχανισμών διαχωρισμού HPLC).
-
Dolan, J. W. (2002). "Προετοιμασία φάσης για κινητά." LCGC Βόρεια Αμερική, Σειρά αντιμετώπισης προβλημάτων. (Βασικός πρακτικός οδηγός για απαέρωση και διήθηση).
-
Aparicio, R. (Επιμ.). (2013). Εγχειρίδιο HPLC Optimization. Elsevier. (Ολοκληρωμένα δεδομένα για την πολικότητα του διαλύτη και την επιλογή του ρυθμιστικού διαλύματος στη χρωματογραφία ανάστροφης φάσης).
-
Agilent Technologies. "Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων συστήματος HPLC: Αποφυγή συνηθισμένων σφαλμάτων κινητής φάσης." Βιβλιοθήκη Τεχνικών Πόρων.
-
Waters Corporation. "Αρχές Χρωματογραφίας: Κανονική Φάση εναντίον Αντίστροφης Φάσης." Εκπαιδευτική σειρά.
-
Διεθνές Συνέδριο για την Εναρμόνιση (ICH). Ε2(R1) Επικύρωση Αναλυτικών Διαδικασιών: Κείμενο και Μεθοδολογία. (Πρότυπο για ποσοτικοποίηση της επιφάνειας αιχμής και σταθερότητα χρόνου διατήρησης).
Αγγλικά
κινέζικα
