Dominar el flujo: una guía para veteranos de laboratorio sobre las fases móviles de HPLC

Introducción

He estado donde estás: mirando un monitor a las 2 de la madrugada, observando una línea de base a la deriva como un barco perdido en el mar, preguntándome si el "HPLC doo-hickey" se inventó sólo para poner a prueba mi cordura. Si se siente delirante al tratar de entender la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), respire. No es sólo una caja de piezas caras; es una danza delicada entre la química y la física.

En el laboratorio, solemos decir que la fase móvil es la "línea de vida" del sistema. Sin él, su muestra simplemente quedará en un inyector y no irá a ninguna parte. Pero, ¿cómo se elige el "tren" adecuado para llevar las moléculas al detector? Analicémoslo como si estuviéramos charlando mientras tomamos un café en la sala de descanso.

1. ¿Qué es realmente la HPLC?

En esencia, la HPLC se trata de separación. Piense en ello como una carrera donde la "pista" es la fase estacionaria (la columna) y el "viento" que empuja a los corredores es la fase móvil hplc.

La magia ocurre porque diferentes moléculas tienen diferentes "afinidades". A algunas moléculas les encanta la fase móvil y avanzan a través de la columna. Otros son "pegajosos": están enamorados de la fase estacionaria y se quedan atrás. Esta diferencia de velocidad es lo que crea esos picos en su cromatograma.

2. Fase normal frente a fase inversa

Aquí es donde todo el mundo suele empezar a arrancarse el pelo. En mis años de práctica, descubrí que la forma más fácil de recordar esto es observando la polaridad.

A. Cromatografía en fase normal

Esta es la forma de la "vieja escuela". En la cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es polar; considérelo como un imán para moléculas polares. La fase móvil que utilizamos aquí no es polar, normalmente disolventes como hexano o heptano.

• La lógica: las moléculas polares "pegajosas" son retenidas por la columna polar. Las moléculas no polares se eliminan rápidamente con la fase móvil no polar.

• El consejo profesional: si aumenta la polaridad de su fase móvil (agregando un poco de isopropanol), sus muestras se moverán más rápido.

B. Cromatografía de fase inversa

Hoy en día, éste es el estándar de oro. Probablemente el 90% del trabajo que hago en el laboratorio implica cromatografía de fase inversa. Aquí le damos la vuelta al guión. La columna es no polar (hidrófoba, como el aceite) y la fase móvil es polar (normalmente una mezcla de agua y metanol o acetonitrilo).

• La lógica: las moléculas (polares) amantes del agua se acercan rápidamente porque odian la columna aceitosa. Las moléculas amantes de las grasas (no polares) se adhieren a la columna como si fueran pegamento.

• Por qué nos encanta: Es predecible, versátil y utiliza solventes a base de agua que son más fáciles de manejar.

3. La "regla de oro" de la calidad de los disolventes

Verá "Grado HPLC" en las etiquetas por una razón. Ni siquiera pienses en usar el grado ACS ni nada menos. ¿Por qué? Porque esas "pequeñas" impurezas en los solventes de menor calidad se acumularán en su columna con el tiempo, matando su resolución y creando extraños picos fantasma.

Utilice siempre agua de grado Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Si su agua está "sucia", su línea de base se verá como una cadena montañosa y pasará tres días tratando de descubrir por qué.

4. Desgasificación y filtración: los asesinos del rendimiento

El aire es el enemigo de la fase móvil hplc. Bajo presión normal, el aire se disuelve en los disolventes. Pero una vez que el solvente llega a la bomba, esas pequeñas burbujas pueden quedar atrapadas en las válvulas de retención o en la celda del detector.

• El resultado: fluctuaciones del caudal, líneas de base pulsantes y tiempos de retención en movimiento.

• La solución: utilice desgasificadores incorporados o filtración por sonicación//vacío si realiza ensayos de alta sensibilidad.

La filtración no es opcional. Incluso los disolventes de calidad HPLC pueden tener partículas microscópicas procedentes del proceso de fabricación o de la tapa de la botella. Filtre siempre a través de una membrana de 0,22 µm o 0,45 µm antes de que toque el depósito. Es una tarea de 5 minutos que puede salvar a tu columna de una muerte prematura.

5. Los amortiguadores y la trampa de cristal

En la cromatografía de fase inversa, utilizamos tampones para mantener estable el pH de las muestras ionizables.

• Consejo profesional: si usó un buffer hoy, lave el sistema con agua pura\/mezcla orgánica antes de irse a casa. Si no lo hace, esas sales cristalizarán y destrozarán los sellos de la bomba.

• La trampa de vidrio: ¿Sabía que si el pH de su fase móvil de hplc es > 8,0, en realidad puede lixiviar iones metálicos de los depósitos de vidrio? Cambie a recipientes de acero inoxidable o plástico especializados en estos casos.

Hagamos que su separación sea perfecta

Lograr la fase móvil correcta es el 80% de la batalla en HPLC. Si tiene problemas con líneas de base de "alfombra peluda", picos de presión o resultados inconsistentes, no pierda ni un día más adivinando.

He pasado miles de horas en el banco solucionando estos problemas exactos. Siempre estaré encantado de compartir algunos consejos "probados en laboratorio" para que su proyecto vuelva a encarrilarse.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Correo electrónico:boonemi@aijirenvial.com
  

Referencias

• Snyder, LR, Kirkland, JJ y Dolan, JW (2011). Introducción a la cromatografía líquida moderna. 3ra edición. John Wiley e hijos. (El "estándar de oro" para comprender los mecanismos de separación por HPLC).

• Dolan, JW (2002). "Preparación de la fase móvil". LCGC Norteamérica, Serie de solución de problemas. (Guía práctica imprescindible para la desgasificación y filtración).

• Aparicio, R. (Ed.). (2013). Manual de optimización de HPLC. Elsevier. (Datos completos sobre polaridad del disolvente y selección de tampón en cromatografía de fase inversa).

• Tecnologías Agilent. "Guía de solución de problemas del sistema HPLC: cómo evitar errores comunes de fase móvil". Biblioteca de recursos técnicos.

• Corporación de Aguas. "Principios de la cromatografía: fase normal frente a fase inversa". Serie Educación.

• Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH). Q2(R1) Validación de procedimientos analíticos: texto y metodología. (Estándar para cuantificación del área de picos y estabilidad del tiempo de retención).