Fluxua menperatzea: HPLC fase mugikorretarako laborategiko beteranoen gida

Sarrera

Zu zauden tokian egon naiz: 2:00etan monitoreari begira, itsasoan galdutako txalupa bat bezala noraezean ikusten, "HPLC doo-hickey" nire zentzua probatzeko asmatu ote zen galdetzen. Burua errendimendu handiko kromatografia likidoaren (HPLC) inguruan bildu nahian eldarnio sentitzen baduzu, hartu arnasa. Ez da pieza garestien kutxa bat bakarrik; kimika eta fisikaren arteko dantza delikatua da.

Laborategian, askotan esan ohi dugu fase mugikorra sistemaren "bizi-lerroa" dela. Hori gabe, zure lagina injektore batean eserita dago, inora ez. Baina nola aukeratzen duzu "tren" egokia zure molekulak detektagailura eramateko? Apurtu dezagun atsedenaldiko kafe bat hartzen ari bagina bezala.

1. Zer da HPLC, benetan?

Bere oinarrian, HPLC bereizketari buruzkoa da. Pentsa ezazu lasterketa bat bezala, non "pista" fase geldikoa den (zutabea) eta korrikalariak bultzatzen dituen "haizea" hplc fase mugikorra den.

Magia gertatzen da molekula ezberdinek "afinitate" desberdinak dituztelako. Molekula batzuek fase mugikorra maite dute eta zutabea handitzen dute. Beste batzuk "itsatsuak" dira: fase geldikorrean maiteminduta daude eta atzean geratzen dira. Abiadura-desberdintasun hori da zure kromatograman gailur horiek sortzen dituena.

2. Fase Normala vs Alderantzizko Fasea

Hau da, normalean, denak ilea ateratzen hasten dira. Praktikan egindako urteetan, hori gogoratzeko modurik errazena polaritateari erreparatzea dela aurkitu dut.

A. Fase Normalaren Kromatografia

Hau "eskola zaharra" modua da. Fase normalaren kromatografian, fase geldikoa polarra da; pentsa molekula polarentzako iman bat bezala. Hemen erabiltzen dugun fase mugikorra ez-polarra da, normalean hexanoa edo heptanoa bezalako disolbatzaileak.

• Logika: molekula polarrak zutabe polarrak eusten ditu. Molekula ez polarrak azkar garbitzen dira fase mugikor ez polarrarekin.

• Pro Aholkua: zure fase mugikorraren polaritatea handitzen baduzu (isopropanol pixka bat gehituz), zure laginak azkarrago mugituko dira.

B. Alderantzizko Fasearen Kromatografia

Gaur egun, hau da urrezko estandarra. Ziurrenik laborategian egiten dudan lanaren %90 alderantzizko faseko kromatografia dakar. Hemen, gidoia irauli dugu. Zutabea ez-polarra da (hidrofoboa, olioa bezala), eta fase mugikorra polarra da (normalean ura eta metanol edo azetonitrilo nahasketa bat).

• Logika: ura maite duten molekulek (polarrak) zooma egiten dute zutabe koipetsua gorroto dutelako. Gantz-zaleak (ez-polarrak) molekulak zutabean itsasten dira kola bezala.

• Zergatik maite dugu: aurreikusgarria, polifazetikoa da eta kudeatzeko errazagoak diren uretan oinarritutako disolbatzaileak erabiltzen ditu.

3. Disolbatzaileen Kalitatearen "Urrezko Araua".

"HPLC Grade" ikusiko duzu etiketetan arrazoi batengatik. Ez ezazu pentsatu ACS kalifikazioa edo gutxiago erabiltzeaz. Zergatik? Beheko disolbatzaileetan dauden ezpurutasun "txiki" horiek denboran zehar zure zutabean pilatuko direlako, zure bereizmena hil eta gailur mamu bitxiak sortuz.

Erabili beti Milli-Q (18,2 MΩ.cm) graduko ura. Zure ura "zikina" badago, zure oinarri-lerroa mendikate baten itxura izango du, eta hiru egun emango dituzu zergatik asmatzen saiatzen.

4. Desgasifikazioa eta Iragazkia: Performance Killers

Airea da hplc fase mugikorraren etsaia. Presio arruntean, airea disolbatzaileetan disolbatzen da. Baina disolbatzaile horrek ponpa jotzen duenean, burbuila txiki horiek kontrol-balbuletan edo detektagailuen zeluletan harrapatuta geratu daitezke.

• Emaitza: Fluxu-tasaren gorabeherak, oinarrizko lerro pultsak eta atxikipen-denbora mugikorra.

• Konponketa: Erabili desgasagailu integratuak, edo sonication\/hutsean iragazketa sentikortasun handiko entseguak egiten ari bazara.

Iragazkia ez da aukerakoa. HPLC mailako disolbatzaileek ere fabrikazio prozesuko edo botilaren tapoiko partikula mikroskopikoak izan ditzakete. Iragazi beti 0,22 µm edo 0,45 µm-ko mintz batetik zure urtegia ukitu aurretik. 5 minutuko zeregina da, zure zutabea heriotza goiztiar batetik salba dezakeena.

5. Bufferak eta beirazko tranpa

Alderantzizko faseko kromatografian, lagin ionizagarrietarako pH-a egonkor mantentzeko tamponak erabiltzen ditugu.

• Pro Aholkua: gaur egun buffer bat erabili baduzu, garbitu sistema ur puruz\/nahasketa organikoarekin etxera joan aurretik. Ez baduzu, gatz horiek kristalizatu egingo dira eta zure ponparen zigiluak txikituko dituzte.

• Beirazko tranpa: Ba al zenekien zure hplc fase mugikorraren pH > 8.0 bada, kristalezko biltegietatik metalezko ioiak lixibatu ditzakeela? Aldatu altzairu herdoilgaitzezko edo plastikozko ontzi espezializatuetara kasu hauetan.

Lor dezagun zure bereizketa perfektua

Fase mugikorra ondo lortzea HPLCn borrokaren %80 da. "Alfonbra alfonbra" oinarrizko lerroekin, presio-puntekin edo emaitza ez-koherenteekin borrokan ari bazara, ez galdu beste egun bat asmatzen.

Milaka ordu eman ditut bankuan arazo zehatz hauek konpontzen. Beti pozik nago "laborategietan frogatutako" aholku pixka bat partekatzen zure proiektua bide onetik ateratzeko.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Posta elektronikoa:boonemi@aijirenvial.com
  

Erreferentziak

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. eta Dolan, J. W. (2011). Kromatografia likido modernoaren sarrera. 3. Edizioa. John Wiley & Sons. (HPLC bereizketa mekanismoak ulertzeko "Urrezko estandarra").

• Dolan, J. W. (2002). "Fase Mugikorraren Prestaketa". LCGC Ipar Amerika, Arazoak konpontzeko seriea. (Gasagabetzeko eta iragazteko ezinbesteko gida praktikoa).

• Aparicio, R. (Arg.). (2013). HPLC Optimizazio Eskuliburua. Elsevier. (Disolbatzaileen polaritateari eta tamponaren hautaketari buruzko datu integralak alderantzizko faseko kromatografian).

• Agilent Teknologiak. "HPLC sistemaren arazoak konpontzeko gida: Fase mugikorreko akats arruntak saihestea". Baliabide Teknikoen Liburutegia.

• Uren Korporazioa. "Kromatografiaren printzipioak: fase normala vs alderantzizko fasea". Hezkuntza Seriea.

• Harmonizazioari buruzko Nazioarteko Konferentzia (ICH). Q2(R1) Prozedura analitikoen baliozkotzea: testua eta metodologia. (Goren eremuaren kuantifikaziorako eta atxikipen denboraren egonkortasunerako estandarra).