تسلط بر جریان: راهنمای جانباز آزمایشگاه برای فازهای موبایل HPLC

مقدمه

من همانجایی بوده‌ام که شما هستید - ساعت 2 بامداد به یک مانیتور خیره شده‌ام، در حال تماشای یک حرکت پایه مانند یک قایق گمشده در دریا هستم، و به این فکر می‌کنم که آیا "HPLC doo-hickey" فقط برای آزمایش عقل من اختراع شده است. اگر در تلاش برای پیچاندن سر خود به دور کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) احساس هذیان می کنید، نفس بکشید. این فقط یک جعبه قطعات گران قیمت نیست؛ این یک رقص ظریف بین شیمی و فیزیک است.

در آزمایشگاه، ما اغلب می گوییم فاز سیار «خط حیات» سیستم است. بدون آن، نمونه شما فقط در یک انژکتور نشسته است و به جایی نمی رسد. اما چگونه "قطار" مناسب را برای حمل مولکول های خود به آشکارساز انتخاب می کنید؟ بیایید آن را تجزیه کنیم، مثل اینکه در حال چت کردن با یک قهوه در اتاق استراحت هستیم.

1. واقعا HPLC چیست؟

در هسته خود، HPLC در مورد جداسازی است. آن را مانند مسابقه‌ای در نظر بگیرید که در آن «پیست» فاز ثابت (ستون) است و «باد» که دوندگان را به امتداد هل می‌دهد فاز موبایل hplc است.

سحر و جادو به این دلیل اتفاق می افتد که مولکول های مختلف "قرابت" متفاوتی دارند. برخی از مولکول ها فاز متحرک را دوست دارند و از طریق ستون بزرگنمایی می کنند. برخی دیگر "چسبنده" هستند - آنها به فاز ثابت علاقه دارند و عقب می مانند. این تفاوت در سرعت همان چیزی است که آن پیک ها را در کروماتوگرام شما ایجاد می کند.

2. فاز عادی در مقابل فاز معکوس

معمولاً اینجا جایی است که همه شروع به کندن موهای خود می کنند. در سال‌های تمرینم، ساده‌ترین راه برای به خاطر سپردن این موضوع، نگاه کردن به قطبیت است.

الف. کروماتوگرافی فاز طبیعی

این روش "مدرسه قدیمی" است. در کروماتوگرافی فاز معمولی، فاز ساکن قطبی است - آن را مانند آهنربایی برای مولکول های قطبی در نظر بگیرید. فاز متحرکی که ما در اینجا استفاده می کنیم غیر قطبی است، معمولا حلال هایی مانند هگزان یا هپتان.

• منطق: مولکول های "چسبنده" قطبی توسط ستون قطبی مهار می شوند. مولکول های غیر قطبی به سرعت با فاز متحرک غیر قطبی شسته می شوند.

• نکته حرفه ای: اگر قطبیت فاز موبایل خود را افزایش دهید (با افزودن کمی ایزوپروپانول)، نمونه های شما در واقع سریعتر حرکت می کنند.

ب. کروماتوگرافی فاز معکوس

امروزه این استاندارد طلایی است. احتمالاً 90 درصد از کارهایی که من در آزمایشگاه انجام می دهم شامل کروماتوگرافی فاز معکوس است. در اینجا، اسکریپت را ورق می زنیم. ستون غیر قطبی (آبگریز، مانند نفت)، و فاز متحرک قطبی است (معمولاً ترکیبی از آب و متانول یا استونیتریل).

• منطق: مولکول های آب دوست (قطبی) به دلیل متنفر بودن از ستون روغنی بزرگ می شوند. مولکول های چربی دوست (غیر قطبی) مانند چسب به ستون می چسبند.

• چرا ما آن را دوست داریم: قابل پیش بینی، همه کاره است و از حلال های مبتنی بر آب استفاده می کند که مدیریت آن آسان تر است.

3. "قاعده طلایی" کیفیت حلال

به دلایلی «درجه HPLC» را روی برچسب‌ها می‌بینید. حتی به استفاده از درجه ACS یا هر چیزی کمتر فکر نکنید. چرا؟ زیرا آن ناخالصی‌های «ریز» در حلال‌های درجه پایین‌تر به مرور زمان روی ستون شما جمع می‌شوند و وضوح شما را از بین می‌برند و قله‌های ارواح عجیبی ایجاد می‌کنند.

همیشه از آب گرید Milli-Q (18.2 MΩ.cm) استفاده کنید. اگر آب شما "کثیف" است، خط پایه شما مانند یک رشته کوه به نظر می رسد و سه روز را صرف تلاش برای کشف دلیل آن خواهید کرد.

4. گاز زدایی و فیلتراسیون: قاتلان عملکرد

هوا دشمن فاز موبایل hplc است. تحت فشار معمولی، هوا در حلال های شما حل می شود. اما هنگامی که حلال به پمپ برخورد می کند، آن حباب های کوچک می توانند در شیرهای بازرسی یا سلول آشکارساز به دام بیفتند.

• نتیجه: نوسانات نرخ جریان، خطوط پایه پالس، و زمان‌های ماندگاری متحرک.

• راه‌حل: اگر از سنجش‌های با حساسیت بالا استفاده می‌کنید، از گاز‌زدای داخلی یا فیلتراسیون سونیکاسیون\/وکیوم استفاده کنید.

فیلتراسیون اختیاری نیست حتی حلال های درجه HPLC می توانند ذرات میکروسکوپی از فرآیند تولید یا درب بطری داشته باشند. همیشه یک غشای 0.22μm یا 0.45μm را قبل از تماس با مخزن فیلتر کنید. این یک کار 5 دقیقه ای است که می تواند ستون شما را از مرگ زودرس نجات دهد.

5. بافرها و تله شیشه ای

در کروماتوگرافی فاز معکوس، از بافرها برای ثابت نگه داشتن PH برای نمونه های قابل یونیزاسیون استفاده می کنیم.

• نکته حرفه ای: اگر امروز از بافر استفاده می کنید، قبل از رفتن به خانه، سیستم را با آب خالص\/ مخلوط ارگانیک بشویید. اگر این کار را نکنید، آن نمک ها متبلور می شوند و مهر و موم پمپ شما را خرد می کنند.

• تله شیشه ای: آیا می دانستید که اگر pH فاز موبایل hplc شما > 8.0 باشد، در واقع می تواند یون های فلزی را از مخازن شیشه ای شسته شود؟ در این موارد به ظروف استیل ضد زنگ یا پلاستیکی تخصصی تغییر دهید.

بیایید جدایی خود را کامل کنیم

درست کردن فاز موبایل 80 درصد نبرد در HPLC است. اگر با خطوط پایه «شگ فرش»، افزایش فشار یا نتایج متناقض دست و پنجه نرم می‌کنید، روز دیگری را برای حدس زدن تلف نکنید.

من هزاران ساعت را روی نیمکت سپری کرده ام تا دقیقاً این مشکلات را عیب یابی کنم. من همیشه خوشحالم که کمی توصیه "آزمایشگاهی اثبات شده" را برای بازگرداندن پروژه شما به مسیر درست به اشتراک می گذارم.

• واتس اپ: 86 18338832256

• ایمیل:boonemi@aijirenvial.com
  

مراجع

• اسنایدر، L. R.، Kirkland، J. J.، و Dolan، J. W. (2011). مقدمه ای بر کروماتوگرافی مایع مدرن. نسخه 3. جان وایلی و پسران ("استاندارد طلا" برای درک مکانیسم های جداسازی HPLC).

• دولان، جی دبلیو (2002). "آماده سازی فاز موبایل." LCGC شمال امریکا، سری عیب یابی. (راهنمای عملی ضروری برای گاز زدایی و فیلتراسیون).

• آپاریسیو، آر (ویرایش). (2013). راهنمای بهینه سازی HPLC. الزویر. (داده های جامع در مورد قطبیت حلال و انتخاب بافر در کروماتوگرافی فاز معکوس).

• فناوری های چابک "راهنمای عیب یابی سیستم HPLC: اجتناب از خطاهای رایج فاز موبایل." کتابخانه منابع فنی

• شرکت واترز "اصول کروماتوگرافی: فاز طبیعی در مقابل فاز معکوس." سری آموزش.

• کنفرانس بین المللی هماهنگ سازی (ICH). Q2 (R1) اعتبار سنجی رویه های تحلیلی: متن و روش. (استاندارد برای کمی سازی سطح پیک و پایداری زمان ماند).