Kattava opas HPLC-näytteiden esikäsittelyyn – suodatus, uuttaminen ja derivatisointi
Uutiset
luokat
KYSYMYS

HPLC-näytteen esikäsittely – vaiheittainen opas

21. lokakuuta 2025
TAGSIT:

Näytteen esikäsittelyn yleiskatsaus

Näytteen esikäsittely sisältää kaikki toimenpiteet ennen injektiota. Punnituksen, liuottamisen ja laimentamisen lisäksi se sisältää myös seuraavat vaiheet:

  • Suodatus
  • Uutto
  • Derivatisointi (esisarakkeen derivatisointi)
  • Nestekromatografia (matalapainepylväskromatografia)

Esikäsittely voidaan suorittaa manuaalisesti tai automaattisesti. Oletko perehtynyt näytteiden esikäsittelyyn?


Derivatisointi

Joitakin näytteitä ei voida edelleenkään injektoida suoraan esikäsittelyn jälkeen. Derivatisointia tarvitaan, jotta yhdisteet, joissa ei ole UV-absorptiota tai fluoresenssia, voidaan havaita UV- tai fluoresenssidetektoreilla.

  • Parantaa herkkyyttä
  • Parantaa erottelua (laadunmuutos)

Mahdollisia ongelmia ovat näytteen häviäminen, kontaminaatio, epätäydelliset reaktiot tai useat sivutuotteet, jotka voivat vaikuttaa tarkkuuteen tai aiheuttaa virheitä.

Näytesuodatus

LC-näytteiden on oltava tasalaatuisia ja hiukkasvapaita; hiukkaset voivat vahingoittaa injektoria tai tukkia kolonnin. Vaiheet sisältävät:

  • Ravista näytettä ennen injektiota ja tarkista hiukkasten, sameuden tai emulsioiden varalta
  • Jos havaitset hiukkasia, suodata näyte kalvolla, joka voi pidättää ≥0,15 μm hiukkasia

Mahdolliset ongelmat: näytteen kontaminaatio, adsorptiota vähentävä komponenttipitoisuus ja liuottimen haihtuminen, joka aiheuttaa virheitä.

Uuttomenetelmät

Uutto erottaa analyytit apuliuottimista tai poistaa häiritsevät aineet (esim. proteiinit). Orgaanisten liuottimien tulee olla vähän myrkyllisiä, haihtuvia, vähän epäpuhtauksia sisältäviä ja liukenevat näyte hyvin.

Yleiset liuottimet: dietyylieetteri, etyyliasetaatti, dikloorimetaani, kloroformi, bentseeni tai seokset.

Uuton jälkeen näytteet voidaan injektoida suoraan tai väkevöidä analyytin pitoisuuden ja herkkyyden lisäämiseksi.

Vesiliukoisen näytteen uutto

  1. Happamat komponentit ja suolat: uuttaa epäpuhtaudet orgaanisella liuottimella, säädä happamaksi, sitten uuttaa tai ruiskuta; tai kuivata N2:n alla ja liuotetaan sopivaan liuottimeen ennen injektiota.
  2. Peruskomponentit ja suolat: uuttaa epäpuhtaudet orgaanisella liuottimella, säädä emäksiseksi, sitten uuttaa tai ruiskuta; tai kuivata N2:n alla ja liuotetaan sopivaan liuottimeen ennen injektiota.
  3. Neutraalit komponentit: uuttaa epäpuhtaudet orgaanisella liuottimella ja analysoida sitten suoraan käänteisfaasikromatografialla.


Rasvaliukoinen näyteuutto

Uutetaan orgaanisella liuottimella tai ruiskutetaan suoraan; tai kuivata N2:n alla ja liuotetaan sopivaan liuottimeen ennen injektiota.


Saastumislähteet

Analyysin mahdolliset kontaminaatiolähteet:

Saastumistyyppi

lähde

Ennaltaehkäisytoimenpiteet

Ympäristö

Haitalliset kaasut, pöly, aerosolit

Pidä instrumenttihuone eristettynä, puhtaana; asentaa AC; ohjauskosteus <70 %; estää kosteutta, korroosiota, tärinää

Säiliöt

Lasi-, keramiikka-, kvartsi- ja muovilaboratoriovälineet

Valitse sopivat säiliöt näytetyypin mukaan; puhdistaa perusteellisesti

Reagenssit

Ei-kromatografialaatuiset reagenssit

Käytä kromatografialaatuisia, erittäin puhtaita tai analyyttisiä reagensseja


Vakioliuoksen valmistus

  • Valmista ensin sisäinen standardiliuos; Käytä samaa erää standardeissa ja näytteissä virheiden vähentämiseksi
  • Aineiden on oltava kromatografialaatuisia ja stabiileja
  • Säilytä standardiliuokset ruskeissa pulloissa alhaisessa lämpötilassa
  • Vitamiineille käytä ruskeita mittapulloja tai suojaa valolta


Yleisiä ongelmia näytteiden esikäsittelyssä ja ratkaisuissa

Ongelma

Syy

Ratkaisu

Epäliittyvät piikit kromatogrammissa

Suodattimen saastuminen

  1. Liota suodatinta näyteliuottimessa ja testaa injektio

  2. Vaihda suodattimen tyyppiä

  3. Käytä vaihtoehtoisia puhdistustekniikoita

Matala huippuvaste (erityisesti alhaisen pitoisuuden näytteet)

Adsorptio suodattimen pinnalle

  1. Vaihda suodattimen tyyppiä

  2. Käsittele kaikki näytteet samoissa olosuhteissa

  3. Käytä vaihtoehtoisia puhdistustekniikoita

Alhainen palautuminen

Epätäydellinen uutto

  1. Lisää uuttoaikaa, käytä kuumaa liuotinta

  2. Säädä puhdistusmenetelmää

Laajennetut piikit, lyhennetty kolonnin käyttöikä

Näytteen häiriöt ja kontaminaatio

Paranna puhdistusmenetelmää

Huono tarkkuus

Epätäydellinen palautuminen

  1. Optimoi tai korvaa derivatisointi, erotus, uuttaminen tai muut olosuhteet

  2. Käytä automaattista käsittelyä tarkkuuden parantamiseksi

Tiedustelu