परिचय
मैं वहीं हूं जहां आप हैं - रात के 2 बजे मॉनिटर पर घूर रहा हूं, समुद्र में खोई हुई नाव की तरह बेसलाइन बहाव देख रहा हूं, सोच रहा हूं कि क्या "एचपीएलसी डू-हिक्की" का आविष्कार सिर्फ मेरी विवेक का परीक्षण करने के लिए किया गया था। यदि आप उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के चारों ओर अपना सिर लपेटने की कोशिश में प्रलाप महसूस कर रहे हैं, तो एक सांस लें। यह महज़ महँगे हिस्सों का एक डिब्बा नहीं है; यह रसायन विज्ञान और भौतिकी के बीच एक नाजुक नृत्य है।
प्रयोगशाला में, हम अक्सर कहते हैं कि मोबाइल चरण सिस्टम की "जीवन रेखा" है। इसके बिना, आपका नमूना बस एक इंजेक्टर में पड़ा रहेगा, कहीं नहीं जाएगा। लेकिन आप अपने अणुओं को डिटेक्टर तक ले जाने के लिए सही "ट्रेन" कैसे चुनते हैं? आइए इसे ऐसे तोड़ें जैसे हम ब्रेकरूम में कॉफी पर बातचीत कर रहे हों।
1. वास्तव में एचपीएलसी क्या है?
इसके मूल में, एचपीएलसी पृथक्करण के बारे में है। इसे एक दौड़ की तरह समझें जहां "ट्रैक" स्थिर चरण (स्तंभ) है और धावकों को अपने साथ धकेलने वाली "हवा" एचपीएलसी मोबाइल चरण है।
जादू इसलिए होता है क्योंकि विभिन्न अणुओं में अलग-अलग "समानताएँ" होती हैं। कुछ अणु गतिशील चरण को पसंद करते हैं और स्तंभ के माध्यम से ज़ूम करते हैं। अन्य लोग "चिपचिपे" होते हैं - उन्हें स्थिर चरण पर क्रश होता है और वे पिछड़ जाते हैं। गति में यह अंतर ही आपके क्रोमैटोग्राम पर उन चोटियों का निर्माण करता है।
2. सामान्य चरण बनाम विपरीत चरण
आमतौर पर यहीं पर हर कोई अपने बाल नोचना शुरू कर देता है। अपने वर्षों के अभ्यास में, मैंने इसे याद रखने का सबसे आसान तरीका ध्रुवीयता को देखना पाया है।
ए. सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी
यह "पुराना स्कूल" तरीका है। सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी में, स्थिर चरण ध्रुवीय होता है - इसे ध्रुवीय अणुओं के लिए एक चुंबक की तरह समझें। यहां हम जिस मोबाइल चरण का उपयोग करते हैं वह गैर-ध्रुवीय है, आमतौर पर हेक्सेन या हेप्टेन जैसे सॉल्वैंट्स।
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तर्क: ध्रुवीय "चिपचिपे" अणुओं को ध्रुवीय स्तंभ द्वारा रोक लिया जाता है। गैर-ध्रुवीय अणु गैर-ध्रुवीय गतिशील चरण के साथ जल्दी से धुल जाते हैं।
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प्रो टिप: यदि आप अपने मोबाइल चरण की ध्रुवता बढ़ाते हैं (थोड़ा सा आइसोप्रोपेनॉल जोड़ते हैं), तो आपके नमूने वास्तव में तेजी से आगे बढ़ेंगे।
बी. रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी
आज यह स्वर्ण मानक है। संभवतः प्रयोगशाला में मैं जो 90% काम करता हूँ उसमें रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी शामिल होती है। यहां, हम स्क्रिप्ट को फ्लिप करते हैं। स्तंभ गैर-ध्रुवीय (हाइड्रोफोबिक, तेल की तरह) है, और चरण मोबाइल ध्रुवीय है (आमतौर पर पानी और मेथनॉल या एसीटोनिट्राइल का मिश्रण)।
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तर्क: जल-प्रेमी (ध्रुवीय) अणु तेजी से बढ़ते हैं क्योंकि वे तैलीय स्तंभ से नफरत करते हैं। वसा-प्रिय (गैर-ध्रुवीय) अणु गोंद की तरह स्तंभ से चिपक जाते हैं।
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हम इसे क्यों पसंद करते हैं: यह पूर्वानुमान योग्य, बहुमुखी है, और पानी-आधारित सॉल्वैंट्स का उपयोग करता है जिन्हें प्रबंधित करना आसान है।
3. विलायक गुणवत्ता का "सुनहरा नियम"।
आपको किसी कारण से लेबल पर "एचपीएलसी ग्रेड" दिखाई देगा। एसीएस ग्रेड या इससे कम किसी चीज़ का उपयोग करने के बारे में सोचें भी नहीं। क्यों? क्योंकि निम्न-श्रेणी के सॉल्वैंट्स में वे "छोटी" अशुद्धियाँ समय के साथ आपके कॉलम पर जमा हो जाएंगी, जिससे आपका संकल्प खत्म हो जाएगा और अजीब भूत चोटियाँ पैदा होंगी।
हमेशा मिल्ली-क्यू (18.2 एमΩ.सेमी) ग्रेड का पानी उपयोग करें। यदि आपका पानी "गंदा" है, तो आपकी आधार रेखा एक पर्वत श्रृंखला की तरह दिखाई देगी, और आप इसका पता लगाने में तीन दिन बिता देंगे।
4. डीगैसिंग और फिल्ट्रेशन: द परफॉरमेंस किलर
वायु एचपीएलसी मोबाइल चरण का दुश्मन है। सामान्य दबाव में, हवा आपके विलायकों में घुल जाती है। लेकिन एक बार जब वह विलायक पंप से टकराता है, तो वे छोटे बुलबुले चेक वाल्व या डिटेक्टर सेल में फंस सकते हैं।
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परिणाम: प्रवाह दर में उतार-चढ़ाव, पल्सिंग बेसलाइन, और चलती अवधारण समय।
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समाधान: यदि आप उच्च-संवेदनशीलता परख चला रहे हैं तो अंतर्निर्मित डिगैसर, या सोनिकेशन\/वैक्यूम निस्पंदन का उपयोग करें।
निस्पंदन वैकल्पिक नहीं है. यहां तक कि एचपीएलसी ग्रेड सॉल्वैंट्स में भी विनिर्माण प्रक्रिया या बोतल कैप से सूक्ष्म कण हो सकते हैं। आपके जलाशय को छूने से पहले हमेशा 0.22µm या 0.45µm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। यह 5 मिनट का कार्य है जो आपके कॉलम को अकाल मृत्यु से बचा सकता है।
5. बफ़र्स और ग्लास ट्रैप
रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी में, हम आयनीकरण योग्य नमूनों के लिए पीएच को स्थिर रखने के लिए बफ़र्स का उपयोग करते हैं।
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प्रो टिप: यदि आपने आज बफर का उपयोग किया है, तो घर जाने से पहले सिस्टम को शुद्ध पानी/जैविक मिश्रण से धो लें। यदि आप ऐसा नहीं करते हैं, तो वे लवण क्रिस्टलीकृत हो जाएंगे और आपके पंप सील को टुकड़े-टुकड़े कर देंगे।
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ग्लास ट्रैप: क्या आप जानते हैं कि यदि आपका एचपीएलसी मोबाइल चरण पीएच > 8.0 है, तो यह वास्तव में ग्लास जलाशयों से धातु आयनों का रिसाव कर सकता है? इन मामलों में स्टेनलेस स्टील या विशेष प्लास्टिक कंटेनर पर स्विच करें।
आइए आपका पृथक्करण पूर्ण करें
एचपीएलसी में 80% लड़ाई मोबाइल चरण को सही ढंग से प्राप्त करना है। यदि आप "शैग कार्पेट" बेसलाइन, दबाव स्पाइक्स, या असंगत परिणामों से जूझ रहे हैं, तो अनुमान लगाने में एक और दिन बर्बाद न करें।
मैंने इन सटीक मुद्दों का निवारण करने के लिए बेंच पर हजारों घंटे बिताए हैं। मुझे आपके प्रोजेक्ट को पटरी पर लाने के लिए कुछ "प्रयोगशाला-सिद्ध" सलाह साझा करने में हमेशा खुशी होती है।
सन्दर्भ
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स्नाइडर, एल.आर., किर्कलैंड, जे.जे., और डोलन, जे.डब्ल्यू. (2011)। आधुनिक तरल क्रोमैटोग्राफी का परिचय। तीसरा संस्करण. जॉन विली एंड संस। (एचपीएलसी पृथक्करण तंत्र को समझने के लिए "स्वर्ण मानक")।
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डोलन, जे.डब्ल्यू. (2002)। "मोबाइल चरण की तैयारी।" एलसीजीसी उत्तरी अमेरिका, समस्या निवारण श्रृंखला। (डीगैसिंग और निस्पंदन के लिए आवश्यक व्यावहारिक मार्गदर्शिका)।
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अपारिसियो, आर. (सं.). (2013)। एचपीएलसी अनुकूलन का मैनुअल। एल्सेवियर। (रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी में विलायक ध्रुवीयता और बफर चयन पर व्यापक डेटा)।
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हार्मोनाइजेशन पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन (आईसीएच)। Q2(R1) विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का सत्यापन: पाठ और कार्यप्रणाली। (चरम क्षेत्र परिमाणीकरण और अवधारण समय स्थिरता के लिए मानक)।
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