Sveobuhvatni vodič za HPLC predtretman uzorka – filtracija, ekstrakcija i derivatizacija
Dom
Vijesti
kategorije
UPIT

HPLC predtretman uzorka – vodič korak po korak

21. listopada 2025
OZNAKE:

Pregled uzorka predtretmana

Predobrada uzorka uključuje sve radnje prije ubrizgavanja. Osim vaganja, otapanja i razrjeđivanja, također uključuje sljedeće korake:

  • Filtriranje
  • Ekstrakcija
  • Derivatizacija (derivacija prije stupca)
  • Tekućinska kromatografija (niskotlačna kromatografija na stupcu)

Predtretman se može izvesti ručno ili automatizirano. Jeste li upoznati s predobradom uzorka?


Derivatizacija

Neki se uzorci još uvijek ne mogu izravno ubrizgati nakon predtretmana. Derivatizacija je potrebna kako bi se spojevi bez UV apsorpcije ili fluorescencije mogli detektirati UV ili fluorescentnim detektorima.

  • Poboljšava osjetljivost
  • Poboljšava razdvajanje (promjena kvalitete)

Mogući problemi uključuju gubitak uzorka, kontaminaciju, nepotpune reakcije ili više nusproizvoda, što može utjecati na točnost ili unijeti pogreške.

Filtriranje uzorka

LC uzorci moraju biti jednolični i bez čestica; čestice mogu oštetiti injektor ili blokirati kolonu. Koraci uključuju:

  • Protresite uzorak prije ubrizgavanja i provjerite ima li čestica, zamućenosti ili emulzija
  • Ako se uoče čestice, filtrirajte uzorak pomoću membrane koja može zadržati čestice ≥0,15 μm

Mogući problemi: kontaminacija uzorka, koncentracija komponente koja smanjuje adsorpciju i isparavanje otapala koje uzrokuje pogreške.

Metode ekstrakcije

Ekstrakcija odvaja analite od suotapala ili uklanja interferirajuće tvari (npr. proteine). Organska otapala trebaju biti nisko toksična, hlapljiva, s niskim sadržajem nečistoća i dobro otapati uzorak.

Uobičajena otapala: dietil eter, etilacetat, diklorometan, kloroform, benzen ili mješavine.

Nakon ekstrakcije, uzorci se mogu ubrizgati izravno ili koncentrirati kako bi se povećala koncentracija analita i osjetljivost.

Ekstrakcija uzorka topivog u vodi

  1. Kisele komponente i soli: ekstrahirajte nečistoće organskim otapalom, podesite na kiselost, zatim ekstrahirajte ili ubrizgajte; ili osušiti pod N₂ i otopiti u odgovarajućem otapalu prije ubrizgavanja.
  2. Osnovne komponente i soli: ekstrahirajte nečistoće organskim otapalom, podesite na bazično, zatim ekstrahirajte ili ubrizgajte; ili osušiti pod N₂ i otopiti u odgovarajućem otapalu prije ubrizgavanja.
  3. Neutralne komponente: ekstrahirajte nečistoće organskim otapalom, zatim analizirajte izravno kromatografijom reverzne faze.


Ekstrakcija uzorka topivog u mastima

Ekstrahirajte organskim otapalom ili ubrizgajte izravno; ili osušiti pod N₂ i otopiti u odgovarajućem otapalu prije ubrizgavanja.


Izvori kontaminacije

Potencijalni izvori kontaminacije u analizi:

Vrsta kontaminacije

Izvor

Mjere prevencije

Ekološki

Štetni plinovi, prašina, aerosoli

Održavajte prostoriju s instrumentima izoliranom, čistom; instalirati AC; kontrolirati vlažnost <70%; spriječiti vlagu, koroziju, vibracije

Kontejneri

Laboratorijsko posuđe od stakla, keramike, kvarca, plastike

Odaberite odgovarajuće spremnike po vrsti uzorka; temeljito očistiti

Reagensi

Reagensi koji nisu kromatografski

Koristite reagense kromatografskog stupnja, visoke čistoće ili analitičkog stupnja


Standardna priprema otopine

  • Prvo pripremite otopinu internog standarda; koristite istu seriju u standardima i uzorcima kako biste smanjili pogreške
  • Tvari moraju biti kromatografske čistoće i stabilne
  • Čuvajte standardne otopine u smeđim bocama na niskoj temperaturi
  • Za vitamine koristite smeđe odmjerne tikvice ili ih zaštitite od svjetlosti


Uobičajeni problemi u prethodnoj obradi uzoraka i otopinama

Problem

Uzrok

Rješenje

Nepovezani vrhovi u kromatogramu

Zagađenje filtera

  1. Namočite filtar u otapalo uzorka i ubrizgajte test

  2. Promjena vrste filtera

  3. Koristite alternativne tehnike čišćenja

Nizak vršni odgovor (osobito uzorci niske koncentracije)

Adsorpcija na površini filtera

  1. Promjena vrste filtera

  2. Obradite sve uzorke pod istim uvjetima

  3. Koristite alternativne tehnike čišćenja

Nizak oporavak

Nepotpuna ekstrakcija

  1. Povećajte vrijeme ekstrakcije, koristite vruće otapalo

  2. Prilagodite način čišćenja

Prošireni vrhovi, skraćeni vijek trajanja stupca

Smetnje i kontaminacija uzorka

Poboljšajte način čišćenja

Loša preciznost

Nepotpuni oporavak

  1. Optimizirajte ili zamijenite derivatizaciju, odvajanje, ekstrakciju ili druge uvjete

  2. Koristite automatizirano rukovanje za poboljšanje preciznosti

Upit