Að ná tökum á flæðinu: Leiðbeiningar öldungadeildar um HPLC farsímastig

Inngangur

Ég hef verið þar sem þú ert - starandi á skjá klukkan 2 að morgni, horft á grunnlínu reka eins og týndan bát á sjó, velti því fyrir mér hvort „HPLC doo-hickey“ hafi verið fundin upp bara til að prófa geðheilsu mína. Ef þú ert í óráði þegar þú reynir að vefja höfuðið um hágæða vökvaskiljun (HPLC), taktu andann. Það er ekki bara kassi af dýrum hlutum; þetta er viðkvæmur dans á milli efnafræði og eðlisfræði.

Í rannsóknarstofunni segjum við oft að farsímafasinn sé „líflína“ kerfisins. Án þess situr sýnið þitt bara í inndælingartæki og fer ekkert. En hvernig velurðu réttu „lestina“ til að flytja sameindir þínar til skynjarans? Við skulum brjóta það niður eins og við séum að spjalla yfir kaffisopa í fundarherberginu.

1. Hvað er HPLC, í alvöru?

Í kjarna þess snýst HPLC um aðskilnað. Hugsaðu um þetta eins og keppni þar sem „brautin“ er kyrrstæðufasinn (súlan) og „vindurinn“ sem ýtir hlaupurunum áfram er hplc hreyfanlegur fasinn.

Galdurinn gerist vegna þess að mismunandi sameindir hafa mismunandi „sækni“. Sumar sameindir elska farsímafasann og þysja í gegnum súluna. Aðrir eru „lístir“ - þeir eru hrifnir af kyrrstöðustiginu og liggja eftir. Þessi munur á hraða er það sem skapar þessa toppa á litskiljuninni þinni.

2. Venjulegur áfangi vs öfugur áfangi

Þetta er venjulega þar sem allir byrja að draga úr hárinu. Á árum mínum hefur mér fundist auðveldasta leiðin til að muna þetta með því að skoða pólun.

A. Venjuleg fasa litskiljun

Þetta er "gamli skólinn" leiðin. Í venjulegri fasaskiljun er kyrrsti fasinn skautaður - hugsaðu um það eins og segull fyrir skautar sameindir. Hreyfanlegur fasi sem við notum hér er óskautaður, venjulega leysiefni eins og hexan eða heptan.

• Rökfræðin: Pólar "límandi" sameindir halda aftur af pólsúlunni. Óskautaðar sameindir skolast fljótt út með óskauta farsímafasanum.

• Pro Ábendingin: Ef þú eykur pólun farsímafasans þíns (bætir við smá ísóprópanóli), munu sýnin þín í raun hreyfast hraðar.

B. Reverse Phase Chromatography

Í dag er þetta gulls ígildi. Líklega 90% af vinnunni sem ég geri á rannsóknarstofunni felur í sér öfugfasaskiljun. Hér snúum við handritinu. Súlan er óskautuð (vatnsfælin, eins og olía), og fasinn hreyfanlegur er skautaður (venjulega blanda af vatni og metanóli eða asetónítríl).

• Rökfræðin: Vatnselskandi (skaut) sameindir þysja í gegn vegna þess að þær hata olíukennda súluna. Fituelskandi (óskautaðar) sameindir festast við súluna eins og lím.

• Af hverju við elskum það: Það er fyrirsjáanlegt, fjölhæft og notar vatnsbundin leysiefni sem er auðveldara að stjórna.

3. „Gullna reglan“ um gæði leysiefna

Þú munt sjá „HPLC einkunn“ á merkimiðum af ástæðu. Ekki einu sinni hugsa um að nota ACS einkunn eða neitt minna. Hvers vegna? Vegna þess að þessi „smá“ óhreinindi í leysiefnum af lægri gráðu munu safnast fyrir á súlunni þinni með tímanum, drepa upplausn þína og búa til undarlega draugatinda.

Notaðu alltaf Milli-Q (18,2 MΩ.cm) vatn. Ef vatnið þitt er „óhreint“ mun grunnlínan þín líta út eins og fjallgarður og þú munt eyða þremur dögum í að finna út hvers vegna.

4. Afgasun og síun: The Performance Killers

Loft er óvinur hplc farsímafasans. Við venjulegan þrýsting leysist loft upp í leysiefnum þínum. En þegar þessi leysir lendir á dælunni geta þessar örsmáu loftbólur festst í afturlokunum eða skynjarafrumunni.

• Niðurstaðan: Flæðissveiflur, púlsandi grunnlínur og hreyfanlegur varðveislutími.

• Lagfæringin: Notaðu innbyggða gashreinsitæki, eða hljóðgjafa\/tómasíun ef þú ert að keyra hánæmni mælingar.

Síun er ekki valfrjáls. Jafnvel HPLC leysiefni geta haft smásæjar agnir frá framleiðsluferlinu eða flöskulokinu. Síuðu alltaf í gegnum 0,22µm eða 0,45µm himnu áður en hún snertir lónið þitt. Þetta er 5 mínútna verkefni sem getur bjargað dálknum þínum frá ótímabærum dauða.

5. Buffer og glergildran

Í öfugfasaskiljun notum við jafna til að halda pH stöðugu fyrir jónanleg sýni.

• Ábending fyrir atvinnumenn: Ef þú notaðir biðminni í dag skaltu þvo kerfið með hreinu vatni\/lífrænni blöndu áður en þú ferð heim. Ef þú gerir það ekki munu þessi sölt kristallast og tæta dæluþéttingarnar í sundur.

• Glergildran: Vissir þú að ef pH í hplc farsímafasa þínum er > 8,0 getur það í raun skolað málmjónir úr glergeymum? Skiptu yfir í ryðfríu stáli eða sérhæfða plastílát í þessum tilvikum.

Við skulum fá aðskilnað þinn fullkominn

Að fá farsímafasann rétt er 80% af bardaganum í HPLC. Ef þú ert í erfiðleikum með grunnlínur „shag teppis“, þrýstingsstökkum eða ósamræmilegum niðurstöðum, ekki eyða einum degi í að giska.

Ég hef eytt þúsundum klukkustunda á bekknum í að leysa nákvæmlega þessi mál. Ég er alltaf fús til að deila smá "lab-sannað" ráð til að koma verkefninu þínu aftur á réttan kjöl.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Netfang:boonemi@aijirenvial.com
  

Heimildir

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. og Dolan, J. W. (2011). Kynning á nútíma vökvaskiljun. 3. útgáfa. John Wiley og synir. („Gullstaðalinn“ til að skilja HPLC aðskilnaðaraðferðir).

• Dolan, J.W. (2002). "Undirbúningur fyrir farsímafasa." LCGC Norður-Ameríka, bilanaleitaröð. (Nauðsynleg hagnýt leiðarvísir fyrir afgasun og síun).

• Aparicio, R. (ritstj.). (2013). Handbók um HPLC hagræðingu. Elsevier. (Alhliða gögn um skautun leysiefna og val á biðminni í öfugfasaskiljun).

• Agilent tækni. "HPLC kerfisbilunarleiðarvísir: Forðastu algengar villur í farsímafasa." Tæknileg auðlindabókasafn.

• Waters Corporation. "Meginreglur litskiljunar: Venjulegur áfangi vs. öfugur fasi." Fræðsluþáttaröð.

• Alþjóðaráðstefna um samræmingu (ICH). Q2(R1) Löggilding greiningarferla: Texti og aðferðafræði. (Staðall fyrir mælingu á toppsvæði og stöðugleika varðveislutíma).