Guida completa al pretrattamento dei campioni HPLC: filtrazione, estrazione e derivatizzazione
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Pretrattamento dei campioni HPLC – Guida passo passo

21 ottobre 2025
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Panoramica del pretrattamento di esempio

Il pretrattamento del campione comprende tutte le operazioni prima dell'iniezione. Oltre a pesare, sciogliere e diluire, prevede anche i seguenti passaggi:

  • Filtrazione
  • Estrazione
  • Derivatizzazione (derivatizzazione pre-colonna)
  • Cromatografia liquida (cromatografia su colonna a bassa pressione)

Il pretrattamento può essere eseguito manualmente o automatizzato. Conosci il pretrattamento dei campioni?


Derivatizzazione

Alcuni campioni non possono ancora essere iniettati direttamente dopo il pretrattamento. La derivatizzazione è necessaria per rendere i composti senza assorbimento UV o fluorescenza rilevabili da rilevatori UV o a fluorescenza.

  • Migliora la sensibilità
  • Migliora la separazione (cambiamento di qualità)

I possibili problemi includono perdita di campione, contaminazione, reazioni incomplete o molteplici sottoprodotti, che potrebbero influire sulla precisione o introdurre errori.

Filtrazione del campione

I campioni LC devono essere uniformi e privi di particelle; le particelle potrebbero danneggiare l'iniettore o bloccare la colonna. I passaggi includono:

  • Agitare il campione prima dell'iniezione e verificare la presenza di particelle, torbidità o emulsioni
  • Se si osservano particelle, filtrare il campione utilizzando una membrana in grado di trattenere particelle ≥0,15μm

Potenziali problemi: contaminazione del campione, concentrazione dei componenti che riducono l'adsorbimento ed evaporazione del solvente che causa errori.

Metodi di estrazione

L'estrazione separa gli analiti dai cosolventi o rimuove le sostanze interferenti (ad esempio proteine). I solventi organici devono essere a bassa tossicità, volatili, poveri di impurità e dissolvere bene il campione.

Solventi comuni: etere etilico, acetato di etile, diclorometano, cloroformio, benzene o miscele.

Dopo l'estrazione, i campioni possono essere iniettati direttamente o concentrati per aumentare la concentrazione e la sensibilità dell'analita.

Estrazione del campione solubile in acqua

  1. Componenti e sali acidi: estrarre le impurità con solvente organico, regolare ad acido, quindi estrarre o iniettare; oppure essiccare sotto N₂ e sciogliere in un solvente appropriato prima dell'iniezione.
  2. Componenti basici e sali: estrarre le impurità con solvente organico, regolare al basico, quindi estrarre o iniettare; oppure essiccare sotto N₂ e sciogliere in un solvente appropriato prima dell'iniezione.
  3. Componenti neutri: estrarre le impurità con solvente organico, quindi analizzare direttamente mediante cromatografia a fase inversa.


Estrazione di campioni liposolubili

Estrarre con solvente organico o iniettare direttamente; oppure essiccare sotto N₂ e sciogliere in un solvente appropriato prima dell'iniezione.


Fonti di contaminazione

Potenziali fonti di contaminazione in analisi:

Tipo di contaminazione

Fonte

Misure di prevenzione

Ambientale

Gas nocivi, polveri, aerosol

Mantenere la sala strumenti isolata e pulita; installare AC; controllo umidità <70%; prevenire umidità, corrosione, vibrazioni

Contenitori

Articoli da laboratorio in vetro, ceramica, quarzo, plastica

Selezionare i contenitori appropriati per tipo di campione; pulire accuratamente

Reagenti

Reagenti non di grado cromatografico

Utilizzare reagenti di grado cromatografico, ad elevata purezza o di grado analitico


Preparazione della soluzione standard

  • Preparare prima la soluzione standard interna; utilizzare lo stesso lotto negli standard e nei campioni per ridurre gli errori
  • Le sostanze devono essere stabili e adatte alla cromatografia
  • Conservare le soluzioni standard in bottiglie marroni a bassa temperatura
  • Per le vitamine, utilizzare matracci tarati marroni o proteggere dalla luce


Problemi comuni nel pretrattamento e nelle soluzioni dei campioni

Problema

Causa

Soluzione

Picchi non correlati nel cromatogramma

Filtrare la contaminazione

  1. Immergere il filtro nel solvente campione e testare l'iniezione

  2. Cambia tipo di filtro

  3. Utilizzare tecniche di pulizia alternative

Risposta di picco bassa (soprattutto campioni a bassa concentrazione)

Adsorbimento sulla superficie del filtro

  1. Cambia tipo di filtro

  2. Elaborare tutti i campioni nelle stesse condizioni

  3. Utilizzare tecniche di pulizia alternative

Recupero basso

Estrazione incompleta

  1. Aumentare il tempo di estrazione, utilizzare solvente caldo

  2. Regolare il metodo di pulizia

Picchi ampliati, durata della colonna ridotta

Interferenza e contaminazione del campione

Migliorare il metodo di pulizia

Scarsa precisione

Recupero incompleto

  1. Ottimizza o sostituisci la derivatizzazione, la separazione, l'estrazione o altre condizioni

  2. Utilizzare la gestione automatizzata per migliorare la precisione

Inchiesta