הקדמה
הייתי איפה שאתה - בוהה בצג ב-2 לפנות בוקר, צופה בקו בסיס נסחף כמו סירה אבודה בים, תוהה אם "ה-HPLC doo-hickey" הומצא רק כדי לבדוק את שפיותי. אם אתה מרגיש הזוי בניסיון לעטוף את הראש סביב כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), קחו נשימה. זה לא רק קופסה של חלקים יקרים; זה ריקוד עדין בין כימיה לפיזיקה.
במעבדה אנו אומרים לעתים קרובות שהשלב הנייד הוא "קו החיים" של המערכת. בלי זה, המדגם שלך פשוט יושב במזרק, לא הולך לשום מקום. אבל איך בוחרים את ה"רכבת" הנכונה כדי לשאת את המולקולות לגלאי? בוא נפרק את זה כאילו אנחנו משוחחים על קפה בחדר השבירה.
1. מה זה HPLC, באמת?
בבסיסו, HPLC עוסק בהפרדה. תחשוב על זה כמו מרוץ שבו ה"מסלול" הוא השלב הנייח (העמוד) וה"רוח" שדוחפת את הרצים היא השלב הנייד של hplc.
הקסם קורה מכיוון שלמולקולות שונות יש "זיקות" שונות. חלק מהמולקולות אוהבות את השלב הנייד ומתקרבות בעמודה. אחרים הם "דביקים" - יש להם אהבה לשלב הנייח ונשארים מאחור. ההבדל הזה במהירות הוא מה שיוצר את הפסגות האלה בכרומטוגרמה שלך.
2. שלב רגיל לעומת שלב הפוך
זה בדרך כלל המקום שבו כולם מתחילים לתלוש את השיער. בשנות התרגול שלי, מצאתי את הדרך הקלה ביותר לזכור זאת היא על ידי התבוננות בקוטביות.
א. כרומטוגרפיה שלב רגיל
זו דרך ה"אולד סקול". בכרומטוגרפיה של פאזה רגילה, השלב הנייח הוא קוטבי - חשבו עליו כמו מגנט למולקולות קוטביות. השלב הנייד בו אנו משתמשים כאן אינו קוטבי, בדרך כלל ממיסים כמו הקסאן או הפטן.
-
The Logic: Polar "sticky" molecules get held back by the polar column. Non-polar molecules wash out quickly with the non-polar mobile phase.
-
הטיפ של המקצוענים: אם תגדיל את הקוטביות של הפאזה הניידת שלך (תוסיף קצת איזופרפנול), הדגימות שלך למעשה ינועו מהר יותר.
ב. כרומטוגרפיה פאזה הפוכה
כיום, זהו תקן הזהב. כנראה 90% מהעבודה שאני עושה במעבדה כרוכה בכרומטוגרפיה הפוכה. הנה, אנחנו הופכים את התסריט. העמודה אינה קוטבית (הידרופובית, כמו שמן), והפאזה ניידת היא קוטבית (בדרך כלל תערובת של מים ומתנול או אצטוטריל).
-
The Logic: Water-loving (polar) molecules zoom through because they hate the oily column. מולקולות אוהבות שומן (לא קוטביות) נדבקות לעמוד כמו דבק.
-
למה אנחנו אוהבים את זה: זה צפוי, רב תכליתי, ומשתמש בממיסים על בסיס מים שקל יותר לנהל.
3. "כלל הזהב" של איכות הממס
מסיבה כלשהי תראה "ציון HPLC" על התוויות. אל תחשוב אפילו על שימוש בדרגת ACS או משהו פחות. מַדוּעַ? כי אותם זיהומים "זעירים" בממיסים ברמה נמוכה יותר יצטברו על העמודה שלך עם הזמן, יהרגו את הרזולוציה שלך וייצרו פסגות רפאים מוזרות.
השתמש תמיד במים בדרגת Milli-Q (18.2 MΩ.cm). אם המים שלך "מלוכלכים", קו הבסיס שלך ייראה כמו רכס הרים, ואתה תבלה שלושה ימים בניסיון להבין למה.
4. הסרת גז וסינון: רוצחי הביצועים
האוויר הוא האויב של השלב הנייד של hplc. בלחץ רגיל, האוויר מתמוסס בממיסים שלך. אבל ברגע שהממס הזה פוגע במשאבה, הבועות הזעירות האלה עלולות להילכד בשסתומי הסימון או בתא הגלאי.
-
The Result: Flow rate fluctuations, pulsing baselines, and moving retention times.
-
התיקון: השתמש במסירי גז מובנים, או בסינון\/סינון ואקום אם אתה מפעיל מבחני רגישות גבוהה.
סינון אינו אופציונלי. אפילו ממסים בדרגת HPLC יכולים להיות חלקיקים מיקרוסקופיים מתהליך הייצור או מכסה הבקבוק. סנן תמיד דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר או 0.45 מיקרון לפני שהיא נוגעת במאגר שלך. זוהי משימה של 5 דקות שיכולה להציל את הטור שלך ממוות בטרם עת.
5. חוצצים ומלכודת הזכוכית
בכרומטוגרפיה הפוכה של פאזה, אנו משתמשים במאגרים כדי לשמור על יציבות ה-pH עבור דגימות הניתנות למינון.
-
טיפ מקצוען: אם השתמשתם היום במאגר, שטפו את המערכת במים טהורים\/תערובת אורגנית לפני שאתם הולכים הביתה. אם לא תעשה זאת, המלחים האלה יתגבשו ויקרעו את אטמי המשאבה שלך.
-
מלכודת הזכוכית: האם ידעת שאם ה-pH של הפאזה הניידת של hplc שלך הוא > 8.0, הוא יכול למעשה לשטוף יוני מתכת ממאגרי זכוכית? עבור למכלי נירוסטה או פלסטיק מיוחדים במקרים אלה.
בואו נעשה את הפרידה שלכם מושלמת
ביצוע נכון של שלב הנייד הוא 80% מהקרב ב-HPLC. אם אתה נאבק עם קווי בסיס של "שטיח מעורפל", עליות לחץ או תוצאות לא עקביות, אל תבזבז עוד יום בניחושים.
ביליתי אלפי שעות על הספסל בפתרון בעיות אלו בדיוק. אני תמיד שמח לחלוק עצה "מוכחת במעבדה" כדי להחזיר את הפרויקט שלך למסלול.
הפניות
-
Snyder, L. R., Kirkland, J. J. & Dolan, J. W. (2011). מבוא לכרומטוגרפיית נוזלים מודרנית. מהדורה שלישית. ג'ון ווילי ובניו. ("תקן הזהב" להבנת מנגנוני הפרדת HPLC).
-
Dolan, J. W. (2002). "הכנה לשלב הנייד". LCGC צפון אמריקה, סדרת פתרון בעיות. (מדריך מעשי חיוני להסרת גז וסינון).
-
Aparicio, R. (עורך). (2013). מדריך לאופטימיזציה של HPLC. Elsevier. (Comprehensive data on solvent polarity and buffer selection in reverse phase chromatography).
-
Agilent Technologies. "HPLC System Troubleshooting Guide: Avoiding Common Mobile Phase Errors." ספריית משאבים טכניים.
-
תאגיד ווטרס. "Principles of Chromatography: Normal Phase vs. Reverse Phase." סדרת חינוך.
-
ועידה בינלאומית להרמוניזציה (ICH). Q2(R1) אימות של נהלים אנליטיים: טקסט ומתודולוגיה. (תקן לכימות שטח שיא ויציבות זמן שמירה).
אנגלית
סינית
