흐름 마스터하기: 실험실 베테랑을 위한 HPLC 이동상 가이드

소개

나는 여러분이 있는 곳에 있었습니다. 새벽 2시에 모니터를 바라보며, 바다에서 길을 잃은 배처럼 기준선이 표류하는 모습을 지켜보면서 "HPLC 두-히키"가 단지 내 정신 상태를 테스트하기 위해 발명된 것인지 궁금해했습니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 대해 머리를 감싸려고 할 때 정신이 혼미해지는 느낌이 든다면 한숨을 쉬십시오. 그것은 단지 값비싼 부품이 들어 있는 상자가 아닙니다. 그것은 화학과 물리학 사이의 섬세한 춤입니다.

실험실에서는 이동상이 시스템의 "생명선"이라고 흔히 말합니다. 그것이 없으면 샘플은 인젝터에 그대로 앉아 아무데도 가지 못할 것입니다. 하지만 분자를 검출기까지 운반하는 데 적합한 "열차"를 어떻게 선택합니까? 휴게실에서 커피를 마시며 이야기를 나누듯 이야기를 나눠보자.

1. HPLC란 과연 무엇인가?

HPLC의 핵심은 분리입니다. "트랙"이 정지 단계(기둥)이고 주자를 밀어내는 "바람"이 hplc 이동 단계인 경주처럼 생각하십시오.

이런 마법은 분자마다 "친화력"이 다르기 때문에 발생합니다. 일부 분자는 이동상을 좋아하고 컬럼을 확대합니다. 다른 것들은 "끈적끈적"합니다. 즉, 정지 단계를 좋아하고 뒤쳐지는 것입니다. 이러한 속도 차이로 인해 크로마토그램에 피크가 생성됩니다.

2. 순상 vs. 역상

이것은 일반적으로 모든 사람들이 머리카락을 뽑기 시작하는 곳입니다. 수년간의 연습에서 나는 이것을 기억하는 가장 쉬운 방법은 극성을 보는 것임을 발견했습니다.

A. 순상 크로마토그래피

이것이 "오래된 학교" 방식입니다. 순상 크로마토그래피에서 고정상은 극성입니다. 극성 분자를 위한 자석과 같다고 생각하세요. 여기서 사용하는 이동상은 비극성이며 일반적으로 헥산이나 헵탄과 같은 용매입니다.

• 논리: 극성의 "끈적끈적한" 분자는 극성 기둥에 의해 억제됩니다. 비극성 분자는 비극성 이동상으로 빠르게 세척됩니다.

• 전문가 팁: 이동상의 극성을 높이면(약간의 이소프로판올 추가) 샘플이 실제로 더 빠르게 움직입니다.

B. 역상 크로마토그래피

오늘날 이것이 금본위제입니다. 제가 실험실에서 수행하는 작업의 90%는 역상 크로마토그래피와 관련이 있을 것입니다. 여기에서 스크립트를 뒤집습니다. 컬럼은 비극성(오일과 같은 소수성)이고 상 이동성은 극성(보통 물과 메탄올 또는 아세토니트릴의 혼합물)입니다.

• 논리: 물을 좋아하는(극성) 분자는 기름기둥을 싫어하기 때문에 급격하게 움직입니다. 지방을 좋아하는(비극성) 분자는 접착제처럼 기둥에 달라붙습니다.

• 우리가 좋아하는 이유: 예측 가능하고 다재다능하며 관리가 더 쉬운 수성 용매를 사용합니다.

3. 용매 품질의 "황금률"

이유 때문에 라벨에 "HPLC 등급"이 표시됩니다. ACS 등급이나 그 이하 등급을 사용할 생각은 하지 마세요. 왜? 낮은 등급의 용매에 있는 "작은" 불순물은 시간이 지남에 따라 컬럼에 축적되어 분리능이 저하되고 이상한 고스트 피크가 생성되기 때문입니다.

항상 Milli-Q(18.2 MΩ.cm) 등급의 물을 사용하십시오. 물이 "더러운" 경우 기준선은 산맥처럼 보일 것이며 그 이유를 알아내기 위해 3일을 보내게 됩니다.

4. 탈기 및 여과: 성능 저하 요인

공기는 hplc 이동상의 적입니다. 정상 압력에서 공기는 용매에 용해됩니다. 그러나 용매가 펌프에 닿으면 작은 기포가 체크 밸브나 검출기 셀에 갇힐 수 있습니다.

• 결과: 유속 변동, 펄스 기준선 및 이동하는 머무름 시간.

• 해결책: 고감도 분석을 실행하는 경우 내장된 탈기 장치 또는 초음파 처리\/진공 여과를 사용하십시오.

여과는 선택 사항이 아닙니다. HPLC 등급 용매에도 제조 공정이나 병 뚜껑에서 발생하는 미세한 입자가 있을 수 있습니다. 저장소에 닿기 전에 항상 0.22μm 또는 0.45μm 멤브레인을 통해 필터링하십시오. 당신의 칼럼을 조기 사망으로부터 구할 수 있는 5분짜리 작업입니다.

5. 완충액과 유리 트랩

역상 크로마토그래피에서는 이온화 가능한 시료의 pH를 안정적으로 유지하기 위해 완충액을 사용합니다.

• 전문가 팁: 오늘 버퍼를 사용한 경우 집에 가기 전에 순수한 물\/유기 혼합물로 시스템을 세척하십시오. 그렇지 않으면, 그 염분이 결정화되어 펌프 씰을 파쇄할 것입니다.

• 유리 트랩: hplc 이동상의 pH가 > 8.0인 경우 실제로 유리 저장소에서 금속 이온이 침출될 수 있다는 사실을 알고 계셨습니까? 이러한 경우에는 스테인리스 스틸 또는 특수 플라스틱 용기로 전환하세요.

완벽한 이별을 해보자

이동상을 올바르게 얻는 것이 HPLC 전투의 80%입니다. "샤그 카펫" 기준선, 압력 스파이크 또는 일관되지 않은 결과로 인해 어려움을 겪고 있는 경우 추측하느라 하루를 더 낭비하지 마십시오.

저는 이러한 정확한 문제를 해결하기 위해 벤치에서 수천 시간을 보냈습니다. 저는 귀하의 프로젝트가 정상 궤도에 오를 수 있도록 "실험실에서 입증된" 조언을 공유하게 되어 항상 기쁩니다.

• 왓츠앱: 86 18338832256

• 이메일:boonemi@aijirenvial.com
  

참고자료

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). 현대 액체 크로마토그래피 소개. 제3판. 존 와일리 앤 선즈. (HPLC 분리 메커니즘을 이해하기 위한 "최적 표준").

• 돌란, J.W.(2002). “이동상 준비.” LCGC 북미, 문제 해결 시리즈. (탈기 및 여과에 대한 필수 실무 가이드).

• Aparicio, R. (Ed.). (2013). HPLC 최적화 매뉴얼. 엘스비어. (역상 크로마토그래피의 용매 극성 및 완충액 선택에 대한 종합 데이터)

• 애질런트 테크놀로지스. "HPLC 시스템 문제 해결 가이드: 일반적인 이동상 오류 방지." 기술 자원 라이브러리.

• 워터스 코퍼레이션. “크로마토그래피의 원리: 순상 대 역상.” 교육 시리즈.

• 국제조화회의(ICH). Q2(R1) 분석 절차의 검증: 텍스트 및 방법론. (피크 면적 정량화 및 머무름 시간 안정성에 대한 표준)