Вовед
Сум бил таму каде што сте вие - гледајќи во мониторот во 2 часот по полноќ, гледајќи како лета основната линија како изгубен брод на море, прашувајќи се дали „HPLC doo-hickey“ е измислен само за да го тестира мојот разум. Ако се чувствувате во делириум обидувајќи се да ја завиткате главата околу течната хроматографија со високи перформанси (HPLC), земете здив. Тоа не е само кутија со скапи делови; тоа е деликатен танц помеѓу хемијата и физиката.
Во лабораторијата често велиме дека мобилната фаза е „животната линија“ на системот. Без него, вашиот примерок само седи во инјектор, не оди никаде. Но, како да го изберете вистинскиот „воз“ за да ги носите вашите молекули до детекторот? Ајде да го растуриме како да разговараме на кафе во просторијата за одмор.
1. Што е HPLC, навистина?
Во неговото јадро, HPLC е за одвојување. Помислете на тоа како трка каде што „патеката“ е стационарната фаза (колоната), а „ветрот“ што ги турка тркачите е мобилната фаза на hplc.
Магијата се случува затоа што различни молекули имаат различни „афинитети“. Некои молекули ја сакаат мобилната фаза и зумираат низ колоната. Други се "лепливи" - тие се вљубени во стационарната фаза и заостануваат. Оваа разлика во брзината е она што ги создава тие врвови на вашиот хроматограм.
2. Нормална фаза наспроти обратна фаза
Ова е обично местото каде што сите почнуваат да ја вадат косата. Во моите години на пракса, најдов најлесниот начин да го запомнам ова со гледање на поларитетот.
А. Нормална фаза хроматографија
Ова е начинот на „старата школа“. Во нормална фазна хроматографија, стационарната фаза е поларна - замислете ја како магнет за поларни молекули. Мобилната фаза што ја користиме овде е неполарна, обично растворувачи како хексан или хептан.
-
Логиката: Поларните „лепливи“ молекули се задржуваат од поларната колона. Неполарните молекули брзо се мијат со неполарната мобилна фаза.
-
Професионален совет: Ако го зголемите поларитетот на вашата мобилна фаза (додавање малку изопропанол), вашите примероци всушност ќе се движат побрзо.
Б. Хроматографија на обратна фаза
Денес, ова е златен стандард. Веројатно 90% од работата што ја работам во лабораторија вклучува обратна фазна хроматографија. Еве, го превртуваме сценариото. Колоната е неполарна (хидрофобна, како масло), а подвижната фаза е поларна (обично мешавина од вода и метанол или ацетонитрил).
-
Логиката: Молекулите кои ја сакаат водата (поларните) зумираат затоа што ја мразат мрсната колона. Молекулите кои ги сакаат мастите (неполарните) се лепат на столбот како лепак.
-
Зошто го сакаме: тој е предвидлив, разноврсен и користи растворувачи на база на вода кои се полесни за управување.
3. „Златното правило“ за квалитет на растворувачи
Ќе видите „Оценка HPLC“ на етикетите со причина. Не размислувајте ни да користите ACS одделение или нешто помалку. Зошто? Бидејќи тие „ситни“ нечистотии во растворувачи од понизок степен ќе се акумулираат на вашата колона со текот на времето, убивајќи ја вашата резолуција и создавајќи чудни врвови на духови.
Секогаш користете вода од градба Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Ако вашата вода е „валкана“, вашата основна линија ќе изгледа како планински венец и ќе поминете три дена обидувајќи се да откриете зошто.
4. Дегасирање и филтрирање: убијци на перформанси
Воздухот е непријател на мобилната фаза на hplc. Под нормален притисок, воздухот се раствора во вашите растворувачи. Но, штом тој растворувач ќе ја погоди пумпата, тие ситни меурчиња може да се заробат во обратните вентили или во ќелијата на детекторот.
-
Резултат: флуктуации на стапката на проток, основни линии на пулсирање и времиња на задржување на движење.
-
Поправка: користете вградени дегазири или филтрирање со сончање\/вакуумска филтрација ако извршувате анализи со висока чувствителност.
Филтрацијата не е изборна. Дури и растворувачите од типот HPLC може да имаат микроскопски честички од процесот на производство или од капачето на шишето. Секогаш филтрирајте низ мембрана од 0,22 µm или 0,45 µm пред да го допре вашиот резервоар. Тоа е задача од 5 минути што може да ја спаси вашата колумна од прерана смрт.
5. Бафери и стаклена стапица
Во хроматографијата во обратна фаза, ние користиме пуфери за одржување на стабилна pH вредност за примероците што можат да се јонизираат.
-
Професионален совет: ако денес користевте пуфер, измијте го системот со чиста вода\/органска мешавина пред да одите дома. Ако не го направите тоа, тие соли ќе се кристализираат и ќе ги уништат заптивките на пумпата.
-
Стаклена стапица: Дали знаевте дека ако вашата pH на мобилната фаза на hplc е > 8,0, таа всушност може да исцеди метални јони од стаклените резервоари? Во овие случаи, префрлете се на контејнери од нерѓосувачки челик или специјализирани пластични садови.
Ајде да ја добиеме вашата разделба совршена
Правилно добивање на мобилната фаза е 80% од битката во HPLC. Ако се борите со основните линии на „рунтав тепих“, скокови на притисок или неконзистентни резултати, не губете друг ден со погодување.
Поминав илјадници часови на клупата за решавање на проблемите со овие точни проблеми. Секогаш сум среќен да споделам малку „лабораториски докажани“ совети за да го вратите вашиот проект на вистинскиот пат.
Референци
-
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Вовед во модерна течна хроматографија. 3-то издание. Џон Вајли и синови. („Златен стандард“ за разбирање на механизмите за сепарација на HPLC).
-
Dolan, J. W. (2002). „Подготовка на мобилната фаза“. LCGC Северна Америка, Серија за решавање проблеми. (Суштински практичен водич за дегасирање и филтрирање).
-
Aparicio, R. (Уред.). (2013). Прирачник за оптимизација на HPLC. Елзевиер. (Сеопфатни податоци за поларитет на растворувачи и избор на пуфер во хроматографија со обратна фаза).
-
Агилентни технологии. „Водич за решавање проблеми на системот HPLC: избегнување на вообичаени грешки во мобилната фаза“. Библиотека за технички ресурси.
-
Вотерс корпорација. „Принципи на хроматографија: нормална фаза наспроти обратна фаза“. Образование серија.
-
Меѓународна конференција за хармонизација (ICH). Q2(R1) Валидација на аналитички процедури: текст и методологија. (Стандард за квантификација на површината на врвот и стабилност на времето на задржување).
Англиски јазик
кинески
