फ्लोवर प्रभुत्व मिळवणे: एचपीएलसी मोबाइल फेजसाठी लॅब वेटरन्सचे मार्गदर्शक

परिचय

तुम्ही जिथे आहात तिथे मी गेलो आहे—पहाटे 2 वाजता एका मॉनिटरकडे पहात, समुद्रात हरवलेल्या बोटीप्रमाणे बेसलाइन वाहताना पाहत होतो, आश्चर्य वाटले की "HPLC डू-हिकी" चा शोध फक्त माझ्या विवेकाची चाचणी घेण्यासाठी लावला गेला आहे. उच्च कार्यप्रदर्शन लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) भोवती डोके गुंडाळण्याचा प्रयत्न करताना तुम्हाला विलोभनीय वाटत असल्यास, थोडा श्वास घ्या. हा केवळ महागड्या भागांचा बॉक्स नाही; हे रसायनशास्त्र आणि भौतिकशास्त्र यांच्यातील एक नाजूक नृत्य आहे.

प्रयोगशाळेत, आम्ही अनेकदा म्हणतो की मोबाइल फेज ही सिस्टमची "लाइफ लाइन" आहे. त्याशिवाय, तुमचा नमुना फक्त इंजेक्टरमध्ये बसला आहे, कुठेही जात नाही. पण तुमचे रेणू डिटेक्टरपर्यंत नेण्यासाठी तुम्ही योग्य "ट्रेन" कशी निवडाल? ब्रेकरूममध्ये आपण कॉफीवर गप्पा मारत आहोत त्याप्रमाणे तो खंडित करूया.

1. HPLC म्हणजे काय?

त्याच्या मुळाशी, HPLC विभक्त होण्याबद्दल आहे. एखाद्या शर्यतीप्रमाणे याचा विचार करा जिथे "ट्रॅक" हा स्थिर टप्पा (स्तंभ) आहे आणि धावपटूंना धक्का देणारा "वारा" हा hplc मोबाईल टप्पा आहे.

जादू घडते कारण वेगवेगळ्या रेणूंमध्ये भिन्न "संबध" असतात. काही रेणूंना मोबाईल फेज आवडते आणि कॉलममधून झूम करतात. इतर "चिकट" आहेत - त्यांना स्थिर टप्प्यावर क्रश आहे आणि ते मागे आहेत. वेगातील हा फरक तुमच्या क्रोमॅटोग्रामवर ती शिखरे तयार करतो.

2. सामान्य फेज वि. रिव्हर्स फेज

येथे सहसा प्रत्येकजण आपले केस बाहेर काढू लागतो. माझ्या अनेक वर्षांच्या सरावात, मला हे लक्षात ठेवण्याचा सर्वात सोपा मार्ग सापडला आहे तो म्हणजे ध्रुवीयता पाहून.

A. सामान्य फेज क्रोमॅटोग्राफी

हा "जुनी शाळा" मार्ग आहे. सामान्य टप्प्यातील क्रोमॅटोग्राफीमध्ये, स्थिर टप्पा ध्रुवीय असतो - ध्रुवीय रेणूंसाठी चुंबकासारखा विचार करा. आम्ही येथे वापरत असलेला मोबाईल फेज गैर-ध्रुवीय आहे, सामान्यतः हेक्सेन किंवा हेप्टेन सारखे सॉल्व्हेंट्स.

• तर्कशास्त्र: ध्रुवीय "चिकट" रेणू ध्रुवीय स्तंभाद्वारे रोखले जातात. नॉन-ध्रुवीय रेणू नॉन-ध्रुवीय मोबाईल टप्प्याने लवकर धुऊन जातात.

• प्रो टीप: जर तुम्ही तुमच्या मोबाईल फेजची ध्रुवीयता वाढवली (थोडासा आयसोप्रोपॅनॉल जोडला), तर तुमचे नमुने प्रत्यक्षात वेगाने हलतील.

B. रिव्हर्स फेज क्रोमॅटोग्राफी

आज, हे सुवर्ण मानक आहे. कदाचित मी प्रयोगशाळेत करत असलेल्या 90% कामांमध्ये रिव्हर्स फेज क्रोमॅटोग्राफीचा समावेश आहे. येथे, आम्ही स्क्रिप्ट फ्लिप करतो. स्तंभ नॉन-ध्रुवीय (हायड्रोफोबिक, तेलासारखा) असतो आणि फेज मोबाईल ध्रुवीय असतो (सामान्यतः पाणी आणि मिथेनॉल किंवा एसीटोनिट्रिल यांचे मिश्रण).

• तर्कशास्त्र: पाणी-प्रेमळ (ध्रुवीय) रेणू झूम करतात कारण ते तेलकट स्तंभाचा तिरस्कार करतात. चरबी-प्रेमळ (ध्रुवीय नसलेले) रेणू गोंद सारखे स्तंभाला चिकटतात.

• आम्हाला ते का आवडते: हे अंदाज लावता येण्याजोगे, अष्टपैलू आहे आणि पाणी-आधारित सॉल्व्हेंट्स वापरते जे व्यवस्थापित करणे सोपे आहे.

3. दिवाळखोर गुणवत्तेचा "सुवर्ण नियम".

तुम्हाला एका कारणासाठी लेबलवर "HPLC ग्रेड" दिसेल. ACS ग्रेड किंवा त्याहून कमी काहीही वापरण्याचा विचारही करू नका. का? कारण खालच्या दर्जाच्या सॉल्व्हेंट्समधील त्या "लहान" अशुद्धता कालांतराने तुमच्या स्तंभावर जमा होतील, तुमचे रिझोल्यूशन मारून टाकतील आणि विचित्र भूत शिखरे तयार करतील.

नेहमी Milli-Q (18.2 MΩ.cm) दर्जाचे पाणी वापरा. जर तुमचे पाणी "घाणेरडे" असेल, तर तुमची आधाररेषा पर्वतराजीसारखी दिसेल आणि तुम्ही याचे कारण शोधण्यात तीन दिवस घालवाल.

4. डिगॅसिंग आणि फिल्टरेशन: द परफॉर्मन्स किलर

हवा हा hplc मोबाईल फेजचा शत्रू आहे. सामान्य दाबाखाली, तुमच्या सॉल्व्हेंट्समध्ये हवा विरघळते. पण एकदा ते दिवाळखोर पंपावर आदळले की, ते लहान फुगे चेक व्हॉल्व्ह किंवा डिटेक्टर सेलमध्ये अडकू शकतात.

• परिणाम: प्रवाह दर चढ-उतार, स्पंदित बेसलाइन, आणि प्रतिधारण वेळा हलवणे.

• निराकरण: तुम्ही उच्च-संवेदनशीलता चाचणी चालवत असल्यास अंगभूत डिगॅसर्स किंवा sonication\/व्हॅक्यूम फिल्टरेशन वापरा.

फिल्टरेशन पर्यायी नाही. HPLC ग्रेड सॉल्व्हेंट्समध्ये देखील उत्पादन प्रक्रियेतून किंवा बाटलीच्या कॅपमधून सूक्ष्म कण असू शकतात. तुमच्या जलाशयाला स्पर्श करण्यापूर्वी नेहमी 0.22µm किंवा 0.45µm पडद्याद्वारे फिल्टर करा. हे 5-मिनिटांचे कार्य आहे जे तुमच्या स्तंभाला अकाली मृत्यूपासून वाचवू शकते.

5. बफर आणि ग्लास ट्रॅप

रिव्हर्स फेज क्रोमॅटोग्राफीमध्ये, आम्ही ionizable नमुन्यांसाठी pH स्थिर ठेवण्यासाठी बफर वापरतो.

• प्रो टीप: आज तुम्ही बफर वापरत असल्यास, तुम्ही घरी जाण्यापूर्वी सिस्टम शुद्ध पाण्याने\/ऑर्गेनिक मिश्रणाने धुवा. जर तुम्ही तसे केले नाही तर ते लवण स्फटिक बनतील आणि तुमचे पंप सील तुकडे करतील.

• काचेचा सापळा: तुम्हाला माहित आहे का की जर तुमचा hplc मोबाईल फेज pH > 8.0 असेल, तर ते काचेच्या जलाशयातून धातूचे आयन सोडू शकते? या प्रकरणांमध्ये स्टेनलेस स्टील किंवा विशेष प्लास्टिक कंटेनरवर स्विच करा.

चला तुमचे वेगळेपण परिपूर्ण होऊ द्या

HPLC मधील 80% लढाई मोबाईल फेज योग्य मिळवणे आहे. जर तुम्हाला "शॅग कार्पेट" बेसलाइन्स, प्रेशर स्पाइक्स किंवा विसंगत परिणामांचा सामना करावा लागत असेल, तर अंदाज लावण्यात आणखी एक दिवस वाया घालवू नका.

मी या अचूक समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी खंडपीठावर हजारो तास घालवले आहेत. तुमचा प्रकल्प पुन्हा रुळावर आणण्यासाठी थोडा "लॅब-सिद्ध" सल्ला शेअर करण्यात मला नेहमीच आनंद होतो.

• WhatsApp: 86 18338832256

• ईमेल:boonemi@aijirenvial.com
  

संदर्भ

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). आधुनिक लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचा परिचय. 3री आवृत्ती. जॉन विली आणि सन्स. (HPLC पृथक्करण यंत्रणा समजून घेण्यासाठी "गोल्ड स्टँडर्ड").

• डोलन, जे. डब्ल्यू. (2002). "मोबाइल फेज तयारी." LCGC उत्तर अमेरिका, समस्यानिवारण मालिका. (डिगॅसिंग आणि फिल्टरेशनसाठी आवश्यक व्यावहारिक मार्गदर्शक).

• अपारिशियो, आर. (एड.). (2013). HPLC ऑप्टिमायझेशन मॅन्युअल. एल्सेव्हियर. (रिव्हर्स फेज क्रोमॅटोग्राफीमध्ये सॉल्व्हेंट पोलॅरिटी आणि बफर सिलेक्शनवरील सर्वसमावेशक डेटा).

• Agilent तंत्रज्ञान. "HPLC सिस्टम समस्यानिवारण मार्गदर्शक: सामान्य मोबाइल फेज त्रुटी टाळणे." तांत्रिक संसाधन लायब्ररी.

• वॉटर कॉर्पोरेशन. "क्रोमॅटोग्राफीची तत्त्वे: सामान्य टप्पा विरुद्ध. उलट फेज." शिक्षण मालिका.

• इंटरनॅशनल कॉन्फरन्स ऑन हार्मोनायझेशन (ICH). Q2(R1) विश्लेषणात्मक प्रक्रियांचे प्रमाणीकरण: मजकूर आणि कार्यपद्धती. (पीक क्षेत्र परिमाण आणि धारणा वेळ स्थिरतेसाठी मानक).