pengenalan
Saya pernah ke tempat anda—merenung monitor pada pukul 2 pagi, melihat garis dasar hanyut seperti bot yang hilang di laut, tertanya-tanya sama ada "HPLC doo-hickey" dicipta hanya untuk menguji kewarasan saya. Jika anda berasa mengigau cuba melilitkan kepala anda pada kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC), tarik nafas. Ia bukan sekadar kotak bahagian mahal; ia adalah tarian halus antara kimia dan fizik.
Di dalam makmal, kita sering mengatakan fasa mudah alih ialah "talian hayat" sistem. Tanpanya, sampel anda hanya duduk di dalam penyuntik, tidak ke mana-mana. Tetapi bagaimana anda memilih "kereta api" yang betul untuk membawa molekul anda ke pengesan? Mari kita memecahkannya seperti kita berbual sambil minum kopi di bilik rehat.
1. Apakah HPLC, Betulkah?
Pada terasnya, HPLC adalah mengenai pemisahan. Fikirkan ia seperti perlumbaan di mana "trek" ialah fasa pegun (lajur) dan "angin" yang menolak pelari bersama ialah fasa mudah alih hplc.
Keajaiban berlaku kerana molekul yang berbeza mempunyai "afiniti" yang berbeza. Sesetengah molekul menyukai fasa mudah alih dan zum melalui lajur. Yang lain "melekit"—mereka menyukai fasa pegun dan ketinggalan. Perbezaan dalam kelajuan inilah yang menghasilkan puncak tersebut pada kromatogram anda.
2. Fasa Biasa lwn Fasa Songsang
Ini biasanya di mana semua orang mula menarik rambut mereka. Dalam tahun-tahun saya berlatih, saya telah menemui cara paling mudah untuk mengingati ini adalah dengan melihat kekutuban.
A. Kromatografi Fasa Biasa
Ini adalah cara "sekolah lama". Dalam kromatografi fasa biasa, fasa pegun adalah kutub—anggaplah ia seperti magnet untuk molekul kutub. Fasa mudah alih yang kami gunakan di sini adalah non-polar, biasanya pelarut seperti heksana atau heptana.
-
Logiknya: Molekul "melekit" kutub ditahan oleh lajur kutub. Molekul bukan kutub dibasuh dengan cepat dengan fasa mudah alih bukan kutub.
-
Petua Pro: Jika anda meningkatkan kekutuban fasa mudah alih anda (menambah sedikit isopropanol), sampel anda sebenarnya akan bergerak lebih pantas.
B. Kromatografi Fasa Terbalik
Hari ini, ini adalah piawaian emas. Mungkin 90% daripada kerja yang saya lakukan di makmal melibatkan kromatografi fasa terbalik. Di sini, kita selak skrip. Lajur adalah bukan kutub (hidrofobik, seperti minyak), dan fasa mudah alih adalah kutub (biasanya campuran air dan metanol atau asetonitril).
-
Logiknya: Molekul yang menyukai air (kutub) mengezum melalui kerana mereka membenci lajur berminyak. Molekul penyayang lemak (bukan polar) melekat pada lajur seperti gam.
-
Sebab kami menyukainya: Ia boleh diramal, serba boleh dan menggunakan pelarut berasaskan air yang lebih mudah diurus.
3. "Peraturan Emas" Kualiti Pelarut
Anda akan melihat "Gred HPLC" pada label atas sebab tertentu. Jangan berfikir tentang menggunakan gred ACS atau apa-apa yang kurang. kenapa? Kerana kekotoran "kecil" dalam pelarut gred rendah itu akan terkumpul pada lajur anda dari semasa ke semasa, membunuh resolusi anda dan mewujudkan puncak hantu yang pelik.
Sentiasa gunakan air gred Milli-Q (18.2 MΩ.cm). Jika air anda "kotor", garis dasar anda akan kelihatan seperti banjaran gunung, dan anda akan menghabiskan tiga hari untuk mencuba untuk mengetahui sebabnya.
4. Penyahgas dan Penapisan: Pembunuh Prestasi
Udara adalah musuh fasa mudah alih hplc. Di bawah tekanan biasa, udara larut dalam pelarut anda. Tetapi apabila pelarut itu terkena pam, buih-buih kecil itu boleh terperangkap dalam injap sehala atau sel pengesan.
-
Hasilnya: Turun naik kadar aliran, garis dasar berdenyut dan masa pengekalan bergerak.
-
Penyelesaian: Gunakan penyahgas terbina dalam, atau penapisan sonikasi\/vakum jika anda menjalankan ujian kepekaan tinggi.
Penapisan Bukan Pilihan. Malah pelarut gred HPLC boleh mempunyai zarah mikroskopik daripada proses pembuatan atau penutup botol. Sentiasa tapis melalui membran 0.22µm atau 0.45µm sebelum ia menyentuh takungan anda. Ia merupakan tugasan selama 5 minit yang boleh menyelamatkan lajur anda daripada kematian pramatang.
5. Penampan dan Perangkap Kaca
Dalam kromatografi fasa terbalik, kami menggunakan penimbal untuk memastikan pH stabil untuk sampel boleh terion.
-
Petua Pro: Jika anda menggunakan penimbal hari ini, basuh sistem dengan air tulen\/campuran organik sebelum anda pulang ke rumah. Jika anda tidak melakukannya, garam tersebut akan menghablur dan mengoyakkan pengedap pam anda.
-
Perangkap Kaca: Adakah anda tahu bahawa jika pH fasa mudah alih hplc anda ialah > 8.0, ia sebenarnya boleh melarutkan ion logam daripada takungan kaca? Beralih kepada keluli tahan karat atau bekas plastik khusus dalam kes ini.
Mari Jadikan Perpisahan Anda Sempurna
Memperbetulkan fasa mudah alih adalah 80% daripada pertempuran dalam HPLC. Jika anda bergelut dengan garis dasar "permaidani shag", lonjakan tekanan atau hasil yang tidak konsisten, jangan buang masa untuk meneka.
Saya telah menghabiskan beribu-ribu jam di bangku simpanan untuk menyelesaikan masalah yang tepat ini. Saya sentiasa gembira untuk berkongsi sedikit nasihat "terbukti makmal" untuk mengembalikan projek anda ke landasan yang betul.
Rujukan
-
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Pengenalan kepada Kromatografi Cecair Moden. Edisi ke-3. John Wiley & Sons. ("Piawaian Emas" untuk memahami mekanisme pemisahan HPLC).
-
Dolan, J. W. (2002). "Persediaan Fasa Mudah Alih." LCGC Amerika Utara, Siri Penyelesaian Masalah. (Panduan praktikal penting untuk penyahgas dan penapisan).
-
Aparicio, R. (Ed.). (2013). Manual Pengoptimuman HPLC. Lain-lain. (Data komprehensif mengenai kekutuban pelarut dan pemilihan penimbal dalam kromatografi fasa terbalik).
-
Teknologi Agilent. "Panduan Penyelesaian Masalah Sistem HPLC: Mengelakkan Ralat Fasa Mudah Alih Biasa." Perpustakaan Sumber Teknikal.
-
Perbadanan Perairan. "Prinsip Kromatografi: Fasa Normal lwn Fasa Songsang." Siri Pendidikan.
-
Persidangan Antarabangsa mengenai Pengharmonian (ICH). S2(R1) Pengesahan Prosedur Analisis: Teks dan Metodologi. (Standard untuk kuantifikasi kawasan puncak dan kestabilan masa pengekalan).
Inggeris
cina
