Nikkontrollaw il-Fluss: Gwida tal-Veteran tal-Lab għall-Fażijiet Mobbli HPLC

Introduzzjoni

Jien kont fejn int—nħares lejn monitor fis-2 AM, nara linja bażi drift bħal dgħajsa mitlufa fuq il-baħar, nistaqsi jekk il-"HPLC doo-hickey" kienx ivvintat biss biex jittestja s-sanità tiegħi. Jekk qed tħoss id-delirju tipprova tkebbeb rasek madwar kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC), ħu nifs. Mhuwiex biss kaxxa ta 'partijiet għaljin; huwa żfin delikat bejn il-kimika u l-fiżika.

Fil-laboratorju, ħafna drabi ngħidu li l-fażi mobbli hija l-"linja tal-ħajja" tas-sistema. Mingħajrha, il-kampjun tiegħek huwa biss bilqiegħda f'injettur, u ma jmur imkien. Imma kif tagħżel it-tajba "ferrovija" biex iġorr il-molekuli tiegħek lejn id-ditekter? Ejja nkissruha qisna qed nitkellmu fuq kafè fil-breakroom.

1. X'inhu HPLC, Verament?

Fil-qalba tagħha, l-HPLC hija dwar is-separazzjoni. Aħseb dwarha bħal tellieqa fejn il-"track" hija l-fażi stazzjonarja (il-kolonna) u r-"riħ" li jimbotta lir-runners tul huwa l-fażi mobbli tal-hplc.

Il-maġija tiġri minħabba li molekuli differenti għandhom "affinitajiet" differenti. Xi molekuli jħobbu l-fażi mobbli u zoom permezz tal-kolonna. Oħrajn huma “jwaħħlu”—jgħaqqdu l-fażi wieqfa u jibqgħu lura. Din id-differenza fil-veloċità hija dik li toħloq dawk il-qċaċet fuq il-kromatogramma tiegħek.

2. Fażi normali vs Fażi Reverse

Normalment dan ikun fejn kulħadd jibda jiġbed xagħaru. Fis-snin ta 'prattika tiegħi, sibt l-eħfef mod biex niftakar dan huwa billi nħares lejn il-polarità.

A. Kromatografija tal-Fażi Normali

Dan huwa l-mod "skola l-qadima". Fil-kromatografija tal-fażi normali, il-fażi stazzjonarja hija polari — aħseb fiha bħal kalamita għall-molekuli polari. Il-fażi mobbli li nużaw hawnhekk hija mhux polari, normalment solventi bħal hexane jew heptane.

• Il-Loġika: Il-molekuli polari "jwaħħal" jinżammu lura mill-kolonna polari. Molekuli mhux polari aħsel malajr bil-fażi mobbli mhux polari.

• Il-Pro Tip: Jekk iżżid il-polarità tal-fażi mobbli tiegħek (żżid ftit isopropanol), il-kampjuni tiegħek fil-fatt se jimxu aktar malajr.

B. Kromatografija tal-Fażi Reverse

Illum, dan huwa l-istandard tad-deheb. Probabbilment 90% tax-xogħol li nagħmel fil-laboratorju jinvolvi kromatografija b'fażi inversa. Hawnhekk, naqleb l-iskrittura. Il-kolonna hija mhux polari (idrofobika, bħaż-żejt), u l-fażi mobbli hija polari (ġeneralment taħlita ta 'ilma u metanol jew aċetonitrile).

• Il-Loġika: Il-molekuli (polari) li jħobbu l-ilma jgħollu għax jobogħdu l-kolonna żejtnija. Molekuli li jħobbu x-xaħam (mhux polari) jeħel mal-kolonna bħal kolla.

• Għaliex inħobbuha: Huwa prevedibbli, versatili, u juża solventi bbażati fuq l-ilma li huma aktar faċli biex jimmaniġġjaw.

3. Ir-"Regola tad-Deheb" tal-Kwalità tas-Solvent

Int ser tara "HPLC Grade" fuq it-tikketti għal raġuni. Lanqas biss taħseb dwar l-użu tal-grad ACS jew xi ħaġa inqas. Għaliex? Minħabba li dawk l-impuritajiet "ċkejkna" f'solventi ta 'grad aktar baxx se jakkumulaw fuq il-kolonna tiegħek maż-żmien, joqtlu r-riżoluzzjoni tiegħek u joħolqu qċaċet ghost stramb.

Dejjem uża ilma tal-grad Milli-Q (18.2 MΩ.cm). Jekk l-ilma tiegħek huwa "maħmuġ," il-linja bażi tiegħek tidher qisha firxa ta 'muntanji, u int ser tqatta' tlett ijiem tipprova tara għaliex.

4. Degassing u Filtrazzjoni: The Performance Killers

L-arja hija l-ghadu tal-fażi mobbli tal-hplc. Taħt pressjoni normali, l-arja tinħall fis-solventi tiegħek. Iżda ladarba dak is-solvent jolqot il-pompa, dawk il-bżieżaq ċkejkna jistgħu jinqabdu fil-valvi ta 'kontroll jew fiċ-ċellula tad-detector.

• Ir-Riżultat: Fluttwazzjonijiet fir-rata tal-fluss, linji bażi pulsanti, u ħinijiet ta 'żamma li jiċċaqalqu.

• Il-Waħħal: Uża degassers integrati, jew filtrazzjoni tal-ivvibrar\/vacuum jekk qed tmexxi analiżi ta 'sensittività għolja.

Il-filtrazzjoni mhix fakultattiva. Anke solventi tal-grad HPLC jista 'jkollhom partiċelli mikroskopiċi mill-proċess tal-manifattura jew l-għatu tal-flixkun. Dejjem iffiltra minn membrana ta' 0.22µm jew 0.45µm qabel ma tmiss il-ġibjun tiegħek. Huwa kompitu ta '5 minuti li jista' jsalva l-kolonna tiegħek minn mewt prematura.

5. Buffers u n-Nassa tal-Ħġieġ

Fil-kromatografija tal-fażi inversa, nużaw buffers biex inżommu l-pH stabbli għal kampjuni jonizzabbli.

• Tip Pro: Jekk użajt buffer illum, aħsel is-sistema b'ilma pur\/taħlita organika qabel ma tmur id-dar. Jekk ma tagħmilx hekk, dawk l-imluħa se jikkristallizzaw u jqattgħu s-siġilli tal-pompa tiegħek.

• In-Nassa tal-Ħġieġ: Kont taf li jekk il-pH tal-fażi mobbli tal-hplc tiegħek hija > 8.0, fil-fatt tista 'tillissija joni tal-metall minn ġibjuni tal-ħġieġ? Aqleb għal kontenituri tal-istainless steel jew tal-plastik speċjalizzati f'dawn il-każijiet.

Ejja Nġibu s-Separazzjoni Tiegħek Perfetta

Li jkollna l-fażi mobbli dritt hija 80% tal-battalja fl-HPLC. Jekk qed tissielet ma 'linji bażi ta' "tapit shag", spikes ta 'pressjoni, jew riżultati inkonsistenti, taħlix ġurnata oħra taqta'.

Jien qattajt eluf ta 'sigħat fuq il-bank biex issolvi l-problemi ta' dawn il-kwistjonijiet eżatti. Jien dejjem kuntent li naqsam daqsxejn ta' pariri "ppruvati fil-laboratorju" biex il-proġett tiegħek jerġa' jseħħ.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Email:boonemi@aijirenvial.com
  

Referenzi

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Introduzzjoni għall-Kromatografija Likwida Moderna. It-3 Edizzjoni. John Wiley & Sons. (Il-"Gold Standard" għall-fehim tal-mekkaniżmi ta 'separazzjoni HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Tħejjija tal-Fażi mobbli." LCGC Amerika ta 'Fuq, Serje ta' Soluzzjoni ta' Problemi. (Gwida prattika essenzjali għad-degassing u l-filtrazzjoni).

• Aparicio, R. (Ed.). (2013). Manwal tal-Ottimizzazzjoni tal-HPLC. Elsevier. (Dejta komprensiva dwar il-polarità tas-solvent u l-għażla tal-buffer fil-kromatografija b'fażi inversa).

• Teknoloġiji Agilent. "Gwida ta' Soluzzjoni ta' Problemi tas-Sistema HPLC: Evita Żbalji Komuni tal-Fażi Mobbli." Librerija tar-Riżorsi Tekniċi.

• Korporazzjoni tal-Ilmijiet. "Prinċipji tal-Kromatografija: Fażi Normali vs Fażi Reverse." Serje Edukazzjoni.

• Konferenza Internazzjonali dwar l-Armonizzazzjoni (ICH). Q2(R1) Validazzjoni ta' Proċeduri Analitiċi: Test u Metodoloġija. (Standard għall-kwantifikazzjoni tal-ogħla żona u l-istabbiltà tal-ħin taż-żamma).