प्रवाहमा महारत हासिल गर्दै: HPLC मोबाइल चरणहरूमा ल्याब वेटरन्स गाइड

परिचय

म तपाई जहाँ हुनुहुन्छ त्यहाँ गएको छु — बिहान २ बजे मनिटरमा हेर्दै, समुद्रमा हराएको डुङ्गा जस्तो आधारभूत बहाव हेर्दै, मेरो विवेक परीक्षण गर्नको लागि "HPLC डू-हिकी" आविष्कार गरिएको हो कि भनेर सोच्दै। यदि तपाइँ उच्च प्रदर्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (HPLC) वरिपरि आफ्नो टाउको लपेट्ने प्रयास गर्दै हुनुहुन्छ भने, एक सास लिनुहोस्। यो महँगो भागहरूको बक्स मात्र होइन; यो रसायन विज्ञान र भौतिक विज्ञान बीचको नाजुक नृत्य हो।

प्रयोगशालामा, हामी प्रायः मोबाइल चरण प्रणालीको "जीवन रेखा" हो भन्दछौं। यो बिना, तपाइँको नमूना केवल एक इन्जेक्टरमा बसिरहेको छ, कतै जाँदैछ। तर तपाईं आफ्नो अणुहरू डिटेक्टरमा लैजान सही "ट्रेन" कसरी छनौट गर्नुहुन्छ? हामी ब्रेकरूममा कफीमा च्याट गरिरहँदा यसलाई तोडौं।

1. HPLC के हो, वास्तवमा?

यसको मूलमा, HPLC विभाजनको बारेमा हो। यसलाई दौडको रूपमा सोच्नुहोस् जहाँ "ट्र्याक" स्थिर चरण (स्तम्भ) हो र धावकहरूलाई साथमा धकेल्ने "हावा" hplc मोबाइल चरण हो।

जादू हुन्छ किनभने विभिन्न अणुहरू फरक "सम्बन्ध" हुन्छन्। केही अणुहरू मोबाइल चरण मन पराउँछन् र स्तम्भ मार्फत जुम। अरूहरू "चिपचिपा" हुन्छन् - तिनीहरू स्थिर चरणमा क्रश हुन्छन् र पछाडि हुन्छन्। गतिमा यो भिन्नताले तपाइँको क्रोमेटोग्राममा ती चुचुराहरू सिर्जना गर्दछ।

2. सामान्य चरण बनाम उल्टो चरण

यो सामान्यतया जहाँ सबैले आफ्नो कपाल बाहिर तान्न थाल्छन्। मेरो वर्षको अभ्यासमा, मैले यो सम्झने सबैभन्दा सजिलो तरिका ध्रुवता हेरेर फेला पारेको छु।

A. सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी

यो "पुरानो विद्यालय" तरिका हो। सामान्य चरण क्रोमेटोग्राफीमा, स्थिर चरण ध्रुवीय हुन्छ - यसलाई ध्रुवीय अणुहरूको लागि चुम्बक जस्तै सोच्नुहोस्। हामीले यहाँ प्रयोग गर्ने मोबाइल चरण गैर-ध्रुवीय हो, सामान्यतया हेक्सेन वा हेप्टेन जस्ता विलायकहरू।

• तर्क: ध्रुवीय "चिपचिपा" अणुहरू ध्रुवीय स्तम्भद्वारा फिर्ता राखिन्छन्। गैर-ध्रुवीय अणुहरू गैर-ध्रुवीय मोबाइल चरणको साथ चाँडै धुन्छ।

• प्रो टिप: यदि तपाईंले आफ्नो मोबाइल चरणको ध्रुवता बढाउनुभयो (थोरै आइसोप्रोपनोल थप्दै), तपाईंको नमूनाहरू वास्तवमा छिटो सर्नेछ।

B. रिभर्स फेज क्रोमैटोग्राफी

आज, यो सुनको मानक हो। सायद मैले प्रयोगशालामा गर्ने कामको ९०% रिभर्स फेज क्रोमेटोग्राफी समावेश छ। यहाँ, हामी स्क्रिप्ट फ्लिप। स्तम्भ गैर-ध्रुवीय (हाइड्रोफोबिक, तेल जस्तै), र चरण मोबाइल ध्रुवीय छ (सामान्यतया पानी र मेथानोल वा एसिटोनिट्रिलको मिश्रण)।

• तर्क: पानी-मायालु (ध्रुवीय) अणुहरू जुम मार्फत हुन्छन् किनभने तिनीहरू तेल स्तम्भलाई घृणा गर्छन्। फ्याट-मायालु (गैर-ध्रुवीय) अणुहरू गोंद जस्तै स्तम्भमा टाँस्छन्।

• हामी यसलाई किन मन पराउछौं: यो अनुमान गर्न सकिने, बहुमुखी छ, र पानीमा आधारित विलायकहरू प्रयोग गर्दछ जुन व्यवस्थापन गर्न सजिलो हुन्छ।

3. विलायक गुणस्तरको "सुनौलो नियम"

तपाईंले कुनै कारणको लागि लेबलहरूमा "HPLC ग्रेड" देख्नुहुनेछ। ACS ग्रेड वा कम केहि प्रयोग गर्ने बारे सोच्नुहोस्। किन? किनभने तल्लो-ग्रेड सॉल्भेन्टहरूमा ती "साना" अशुद्धताहरू तपाईंको स्तम्भमा समयसँगै जम्मा हुनेछन्, तपाईंको रिजोल्युसनलाई मार्नेछ र अजीब भूत शिखरहरू सिर्जना गर्नेछ।

सधैं Milli-Q (18.2 MΩ.cm) ग्रेडको पानी प्रयोग गर्नुहोस्। यदि तपाइँको पानी "फोहोर" छ भने, तपाइँको आधार रेखा पहाडको दायरा जस्तो देखिनेछ, र तपाइँ किन पत्ता लगाउन प्रयास गर्न तीन दिन खर्च गर्नुहुनेछ।

4. डिगासिङ र फिल्टरेशन: प्रदर्शन हत्याराहरू

हावा hplc मोबाइल चरण को शत्रु हो। सामान्य दबाब अन्तर्गत, हावा तपाईंको सॉल्भेन्टहरूमा घुलनशील हुन्छ। तर एक पटक त्यो विलायकले पम्पमा हिट गरेपछि, ती साना बुलबुलेहरू चेक भल्भ वा डिटेक्टर सेलमा फसेका हुन सक्छन्।

• नतिजा: प्रवाह दर उतार-चढ़ाव, पल्सिंग बेसलाइनहरू, र अवधारण समयहरू सार्दै।

• फिक्स: बिल्ट-इन डिगासरहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा sonication\/ भ्याकुम फिल्टरेशन यदि तपाईं उच्च-संवेदनशीलता परीक्षणहरू चलाउँदै हुनुहुन्छ भने।

निस्पंदन ऐच्छिक छैन। HPLC ग्रेड सॉल्भेन्टहरूमा पनि निर्माण प्रक्रिया वा बोतल टोपीबाट माइक्रोस्कोपिक कणहरू हुन सक्छन्। तपाईंको जलाशयलाई छुनु अघि सधैं 0.22µm वा 0.45µm झिल्ली मार्फत फिल्टर गर्नुहोस्। यो 5-मिनेट कार्य हो जसले तपाईंको स्तम्भलाई अकाल मृत्युबाट बचाउन सक्छ।

5. बफर र गिलास जाल

उल्टो चरण क्रोमेटोग्राफीमा, हामी ionizable नमूनाहरूको लागि pH स्थिर राख्न बफरहरू प्रयोग गर्छौं।

• प्रो टिप: यदि तपाईंले आज बफर प्रयोग गर्नुभयो भने, घर जानु अघि शुद्ध पानी \/ जैविक मिश्रणले प्रणाली धुनुहोस्। यदि तपाईंले गर्नुभएन भने, ती नुनहरू क्रिस्टलाइज हुनेछन् र तपाईंको पम्प सीलहरू टुक्रा पार्नेछन्।

• गिलास जाल: के तपाईलाई थाहा छ कि यदि तपाईको hplc मोबाइल चरण pH > 8.0 छ भने, यसले वास्तवमा कांचको जलाशयबाट धातु आयनहरू लीच गर्न सक्छ? यी अवस्थामा स्टेनलेस स्टील वा विशेष प्लास्टिक कन्टेनरहरूमा स्विच गर्नुहोस्।

तपाईंको बिछोडलाई उत्तम बनाउनुहोस्

HPLC मा लडाईको 80% सही मोबाइल चरण प्राप्त गर्न हो। यदि तपाइँ "शाग कार्पेट" आधारभूत रेखाहरू, दबाब स्पाइकहरू, वा असंगत परिणामहरूसँग संघर्ष गर्दै हुनुहुन्छ भने, अर्को दिन अनुमान गर्न बर्बाद नगर्नुहोस्।

मैले बेन्चमा हजारौं घण्टा बिताएँ यी सही मुद्दाहरूको समस्या निवारण गर्न। तपाईको प्रोजेक्टलाई ट्र्याकमा फिर्ता लिनको लागि "ल्याब-प्रोभेन" सल्लाह साझा गर्न पाउँदा म सधैं खुसी छु।

• व्हाट्सएप: 86 18338832256

• इमेल:boonemi@aijirenvial.com
  

सन्दर्भहरू

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011)। आधुनिक तरल क्रोमैटोग्राफी को परिचय। तेस्रो संस्करण। जोन विले एन्ड सन्स। (HPLC विभाजन संयन्त्र बुझ्नको लागि "गोल्ड मानक")।

• डोलन, जे डब्ल्यू (२००२)। "मोबाइल चरण तयारी।" LCGC उत्तर अमेरिका, समस्या निवारण श्रृंखला। (डिगासिङ र निस्पंदनको लागि आवश्यक व्यावहारिक गाइड)।

• Aparicio, R. (Ed.) (२०१३)। HPLC अनुकूलन को म्यानुअल। एल्सेभियर। (रिभर्स फेज क्रोमेटोग्राफीमा विलायक ध्रुवता र बफर चयनमा व्यापक डेटा)।

• Agilent टेक्नोलोजीहरू। "HPLC प्रणाली समस्या निवारण गाइड: सामान्य मोबाइल चरण त्रुटिहरू बेवास्ता गर्दै।" प्राविधिक स्रोत पुस्तकालय।

• वाटर्स कर्पोरेशन। "क्रोमेटोग्राफीका सिद्धान्तहरू: सामान्य चरण बनाम उल्टो चरण।" शिक्षा श्रृंखला।

• हर्मोनाइजेसन (आईसीएच) मा अन्तर्राष्ट्रिय सम्मेलन। Q2(R1) विश्लेषणात्मक प्रक्रियाहरूको प्रमाणीकरण: पाठ र विधि। (चरम क्षेत्र परिमाण र अवधारण समय स्थिरता को लागी मानक)।