Introductie
Ik ben geweest waar jij bent: om twee uur 's nachts naar een monitor starend, een basislijn zien afdrijven als een verloren boot op zee, en me afvragend of de "HPLC doo-hickey" alleen is uitgevonden om mijn gezond verstand te testen. Als u zich ijlend voelt terwijl u zich bezighoudt met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), haal dan diep adem. Het is niet zomaar een doos met dure onderdelen; het is een delicate dans tussen scheikunde en natuurkunde.
In het laboratorium zeggen we vaak dat de mobiele fase de ‘levenslijn’ van het systeem is. Zonder dit zit uw monster gewoon in een injector en gaat het nergens heen. Maar hoe kies je de juiste ‘trein’ om je moleculen naar de detector te vervoeren? Laten we het opsplitsen alsof we aan het kletsen zijn tijdens een kopje koffie in de kantine.
1. Wat is HPLC eigenlijk?
In de kern gaat HPLC over scheiding. Zie het als een race waarbij de "baan" de stationaire fase (de kolom) is en de "wind" die de lopers voortstuwt de hplc mobiele fase is.
De magie gebeurt omdat verschillende moleculen verschillende 'affiniteiten' hebben. Sommige moleculen houden van de mobiele fase en zoeven door de kolom. Anderen zijn ‘plakkerig’: ze zijn verliefd op de stationaire fase en blijven achter. Dit snelheidsverschil zorgt voor de pieken op je chromatogram.
2. Normale fase versus omgekeerde fase
Dit is meestal waar iedereen zijn haar begint uit te trekken. In mijn jarenlange praktijk heb ik ontdekt dat de gemakkelijkste manier om dit te onthouden is door naar polariteit te kijken.
A. Normale fasechromatografie
Dit is de ‘old school’-manier. Bij normale fasechromatografie is de stationaire fase polair. Zie het als een magneet voor polaire moleculen. De mobiele fase die we hier gebruiken is niet-polair, meestal oplosmiddelen zoals hexaan of heptaan.
-
De logica: Polaire ‘plakkerige’ moleculen worden tegengehouden door de polaire kolom. Niet-polaire moleculen spoelen snel uit met de niet-polaire mobiele fase.
-
De professionele tip: Als u de polariteit van uw mobiele fase verhoogt (door een beetje isopropanol toe te voegen), zullen uw monsters daadwerkelijk sneller bewegen.
B. Omgekeerde fasechromatografie
Tegenwoordig is dit de gouden standaard. Waarschijnlijk heeft 90% van het werk dat ik in het laboratorium doe betrekking op omgekeerde fasechromatografie. Hier draaien we het script om. De kolom is niet-polair (hydrofoob, zoals olie) en de mobiele fase is polair (meestal een mengsel van water en methanol of acetonitril).
-
De logica: Waterminnende (polaire) moleculen zoeven door omdat ze de olieachtige kolom haten. Vetminnende (niet-polaire) moleculen blijven als lijm aan de kolom plakken.
-
Waarom we ervan houden: Het is voorspelbaar, veelzijdig en maakt gebruik van oplosmiddelen op waterbasis die gemakkelijker te beheren zijn.
3. De ‘Gouden Regel’ voor de kwaliteit van oplosmiddelen
Er staat niet voor niets 'HPLC-kwaliteit' op etiketten. Denk er niet eens aan om ACS-kwaliteit of iets minder te gebruiken. Waarom? Omdat die "kleine" onzuiverheden in oplosmiddelen van lagere kwaliteit zich in de loop van de tijd op uw kolom zullen ophopen, waardoor uw resolutie teniet wordt gedaan en vreemde spookpieken ontstaan.
Gebruik altijd water van Milli-Q-kwaliteit (18,2 MΩ.cm). Als je water ‘vies’ is, ziet je basislijn eruit als een bergketen, en je zult drie dagen besteden aan het uitzoeken waarom.
4. Ontgassing en filtratie: de prestatiemoordenaars
Lucht is de vijand van de hplc mobiele fase. Onder normale druk lost lucht op in uw oplosmiddelen. Maar zodra dat oplosmiddel de pomp raakt, kunnen die kleine belletjes vast komen te zitten in de terugslagkleppen of de detectorcel.
-
Het resultaat: fluctuaties in de stroomsnelheid, pulserende basislijnen en bewegende retentietijden.
-
De oplossing: gebruik ingebouwde ontgassers of ultrasoonapparaat\/vacuümfiltratie als u hooggevoelige tests uitvoert.
Filtratie is niet optioneel. Zelfs oplosmiddelen van HPLC-kwaliteit kunnen microscopisch kleine deeltjes bevatten die afkomstig zijn van het productieproces of van de flesdop. Filter altijd door een membraan van 0,22 µm of 0,45 µm voordat het uw reservoir raakt. Het is een taak van 5 minuten die uw column kan redden van een voortijdige dood.
5. Buffers en de glazen val
Bij omgekeerde fasechromatografie gebruiken we buffers om de pH stabiel te houden voor ioniseerbare monsters.
-
Pro-tip: Als je vandaag een buffer hebt gebruikt, was het systeem dan met zuiver water/organische mix voordat je naar huis gaat. Als u dat niet doet, zullen deze zouten kristalliseren en uw pompafdichtingen versnipperen.
-
De glazen val: Wist u dat als de pH van uw HPLC mobiele fase > 8,0 is, deze daadwerkelijk metaalionen uit glazen reservoirs kan lekken? Schakel in deze gevallen over op roestvrijstalen of speciale plastic containers.
Laten we uw scheiding perfect maken
Het goed krijgen van de mobiele fase is 80% van de strijd bij HPLC. Als u worstelt met basislijnen van 'pluizig tapijt', drukpieken of inconsistente resultaten, verspil dan geen dag meer met raden.
Ik heb duizenden uren op de bank doorgebracht om deze exacte problemen op te lossen. Ik deel altijd graag wat ‘in het laboratorium bewezen’ advies om uw project weer op de rails te krijgen.
Referenties
-
Snyder, LR, Kirkland, JJ, en Dolan, JW (2011). Inleiding tot de moderne vloeistofchromatografie. 3e editie. John Wiley & Zonen. (De "Gouden Standaard" voor het begrijpen van HPLC-scheidingsmechanismen).
-
Dolan, JW (2002). "Mobiele fasevoorbereiding." LCGC Noord-Amerika, serie probleemoplossing. (Essentiële praktische gids voor ontgassen en filtratie).
-
Aparicio, R. (red.). (2013). Handleiding voor HPLC-optimalisatie. Elsevier. (Uitgebreide gegevens over oplosmiddelpolariteit en bufferselectie bij omgekeerde fasechromatografie).
-
Agilent-technologieën. "Handleiding voor het oplossen van HPLC-systemen: veelvoorkomende fouten in de mobiele fase vermijden." Bibliotheek met technische bronnen.
-
Waters Corporation. "Principes van chromatografie: normale fase versus omgekeerde fase." Educatieve serie.
-
Internationale Conferentie over Harmonisatie (ICH). Q2(R1) Validatie van analytische procedures: tekst en methodologie. (Standaard voor kwantificering van het piekoppervlak en stabiliteit van de retentietijd).
Engels
Chinees
