Omfattende veiledning til HPLC-prøveforbehandling – filtrering, ekstraksjon og derivatisering
Nyheter
kategorier
FORESPØRSEL

HPLC prøveforbehandling – trinn-for-trinn-veiledning

21. oktober 2025
TAG:

Oversikt over prøveforbehandling

Prøveforbehandling inkluderer alle operasjoner før injeksjon. Foruten veiing, oppløsning og fortynning, innebærer det også følgende trinn:

  • Filtrering
  • Utvinning
  • Derivatisering (pre-kolonne derivatisering)
  • Væskekromatografi (lavtrykkskolonnekromatografi)

Forbehandling kan utføres manuelt eller automatisert. Er du kjent med prøveforbehandling?


Derivatisering

Noen prøver kan fortsatt ikke injiseres direkte etter forbehandling. Derivatisering er nødvendig for å gjøre forbindelser uten UV-absorpsjon eller fluorescens detekterbare av UV- eller fluorescensdetektorer.

  • Forbedrer følsomheten
  • Forbedrer separasjon (kvalitetsendring)

Mulige problemer inkluderer prøvetap, kontaminering, ufullstendige reaksjoner eller flere biprodukter, som kan påvirke nøyaktigheten eller introdusere feil.

Prøvefiltrering

LC-prøver må være jevne og partikkelfrie; partikler kan skade injektoren eller blokkere kolonnen. Trinn inkluderer:

  • Rist prøven før injeksjon og se etter partikler, turbiditet eller emulsjoner
  • Hvis det observeres partikler, filtrer prøven ved å bruke en membran som kan holde på ≥0,15μm partikler

Potensielle problemer: prøveforurensning, adsorpsjonsreduserende komponentkonsentrasjon og løsningsmiddelfordampning som forårsaker feil.

Ekstraksjonsmetoder

Ekstraksjon skiller analytter fra co-løsningsmidler eller fjerner forstyrrende stoffer (f.eks. proteiner). Organiske løsningsmidler bør være lavtoksisitet, flyktige, lite urenheter og løse prøven godt.

Vanlige løsningsmidler: dietyleter, etylacetat, diklormetan, kloroform, benzen eller blandinger.

Etter ekstraksjon kan prøver injiseres direkte eller konsentreres for å øke analyttkonsentrasjonen og følsomheten.

Vannløselig prøveekstraksjon

  1. Sure komponenter og salter: ekstraher urenheter med organisk løsemiddel, juster til sur, ekstraher eller injiser; eller tørk under N₂ og løs opp i passende løsemiddel før injeksjon.
  2. Grunnleggende komponenter og salter: ekstraher urenheter med organisk løsningsmiddel, juster til basisk, ekstraher eller injiser deretter; eller tørk under N₂ og løs opp i passende løsemiddel før injeksjon.
  3. Nøytrale komponenter: ekstraher urenheter med organisk løsningsmiddel, analyser deretter direkte ved omvendt-fase kromatografi.


Fettløselig prøveekstraksjon

Ekstraher med organisk løsemiddel eller injiser direkte; eller tørk under N₂ og løs opp i passende løsemiddel før injeksjon.


Forurensningskilder

Potensielle kilder til forurensning i analyse:

Type forurensning

Kilde

Forebyggende tiltak

Miljømessig

Skadelige gasser, støv, aerosoler

Hold instrumentrommet isolert, rent; installere AC; kontroller fuktighet <70 %; forhindre fuktighet, korrosjon, vibrasjoner

Containere

Glass, keramikk, kvarts, plast labware

Velg passende beholdere per prøvetype; rengjør grundig

Reagenser

Ikke-kromatografi-grade reagenser

Bruk reagenser av kromatografigrad, høy renhet eller analytisk kvalitet


Forberedelse av standard løsning

  • Forbered intern standardløsning først; bruk samme batch i standarder og prøver for å redusere feil
  • Stoffer må være kromatografisk og stabile
  • Oppbevar standardløsninger i brune flasker ved lav temperatur
  • For vitaminer, bruk brune målekolber eller beskytt mot lys


Vanlige problemer i prøveforbehandling og løsninger

Problem

Årsak

Løsning

Urelaterte topper i kromatogram

Filterforurensning

  1. Bløtlegg filteret i prøveløsningsmiddel og testinjeksjon

  2. Endre filtertype

  3. Bruk alternative rengjøringsteknikker

Lav topprespons (spesielt prøver med lav konsentrasjon)

Adsorpsjon på filteroverflaten

  1. Endre filtertype

  2. Behandle alle prøvene under samme forhold

  3. Bruk alternative rengjøringsteknikker

Lav restitusjon

Ufullstendig utvinning

  1. Øk ekstraksjonstiden, bruk varmt løsemiddel

  2. Juster rengjøringsmetoden

Utvidede topper, forkortet kolonnelevetid

Prøveinterferens og kontaminering

Forbedre rengjøringsmetoden

Dårlig presisjon

Ufullstendig gjenoppretting

  1. Optimaliser eller erstatt derivatisering, separasjon, utvinning eller andre forhold

  2. Bruk automatisert håndtering for å forbedre presisjonen

Forespørsel