Kompleksowy przewodnik po wstępnej obróbce próbek HPLC – filtracja, ekstrakcja i derywatyzacja
Dom
Wiadomości
kategorie
ZAPYTANIE

Wstępna obróbka próbki HPLC – przewodnik krok po kroku

21 października 2025 r
TAGI:

Przykładowy przegląd obróbki wstępnej

Wstępna obróbka próbki obejmuje wszystkie operacje przed wstrzyknięciem. Oprócz ważenia, rozpuszczania i rozcieńczania obejmuje również następujące etapy:

  • Filtracja
  • Ekstrakcja
  • Derywatyzacja (derywatyzacja przedkolumnowa)
  • Chromatografia cieczowa (niskociśnieniowa chromatografia kolumnowa)

Obróbkę wstępną można przeprowadzić ręcznie lub automatycznie. Czy znasz obróbkę wstępną próbek?


Derywatyzacja

Niektórych próbek nadal nie można wstrzyknąć bezpośrednio po obróbce wstępnej. Derywatyzacja jest wymagana, aby związki bez absorpcji UV lub fluorescencji były wykrywalne przez detektory UV lub fluorescencji.

  • Poprawia wrażliwość
  • Poprawia separację (zmiana jakości)

Możliwe problemy obejmują utratę próbki, zanieczyszczenie, niekompletne reakcje lub wiele produktów ubocznych, które mogą mieć wpływ na dokładność lub powodować błędy.

Filtracja próbek

Próbki LC muszą być jednolite i wolne od cząstek; cząstki mogą uszkodzić iniektor lub zablokować kolumnę. Kroki obejmują:

  • Wstrząśnij próbkę przed wstrzyknięciem i sprawdź, czy nie ma cząstek, zmętnienia lub emulsji
  • Jeśli zostaną zaobserwowane cząstki, przefiltruj próbkę za pomocą membrany, która może zatrzymać cząstki o wielkości ≥ 0,15 μm

Potencjalne problemy: zanieczyszczenie próbki, stężenie składników zmniejszające adsorpcję i odparowanie rozpuszczalnika powodujące błędy.

Metody ekstrakcji

Ekstrakcja oddziela anality od współrozpuszczalników lub usuwa substancje zakłócające (np. białka). Rozpuszczalniki organiczne powinny charakteryzować się niską toksycznością, lotnością, niską zawartością zanieczyszczeń i dobrze rozpuszczać próbkę.

Typowe rozpuszczalniki: eter dietylowy, octan etylu, dichlorometan, chloroform, benzen lub mieszaniny.

Po ekstrakcji próbki można wstrzyknąć bezpośrednio lub zagęścić, aby zwiększyć stężenie i czułość analitu.

Ekstrakcja próbek rozpuszczalnych w wodzie

  1. Składniki i sole kwasowe: ekstrahować zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem organicznym, doprowadzić do odczynu kwaśnego, następnie ekstrahować lub wstrzyknąć; lub wysuszyć pod N2 i rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku przed wstrzyknięciem.
  2. Podstawowe składniki i sole: ekstrahować zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem organicznym, doprowadzić do zasadowości, następnie ekstrahować lub wstrzyknąć; lub wysuszyć pod N2 i rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku przed wstrzyknięciem.
  3. Składniki obojętne: ekstrahować zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem organicznym, następnie analizować bezpośrednio metodą chromatografii z odwróconymi fazami.


Ekstrakcja próbek rozpuszczalnych w tłuszczach

Ekstrahować rozpuszczalnikiem organicznym lub wstrzykiwać bezpośrednio; lub wysuszyć pod N2 i rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku przed wstrzyknięciem.


Źródła zanieczyszczeń

Potencjalne źródła zanieczyszczeń w analizie:

Rodzaj zanieczyszczenia

Źródło

Środki zapobiegawcze

Środowiskowy

Szkodliwe gazy, pyły, aerozole

Utrzymuj pomieszczenie przyrządowe odizolowane i czyste; zainstaluj klimatyzację; kontroluj wilgotność <70%; zapobiegać wilgoci, korozji i wibracjom

Kontenery

Szkło, ceramika, kwarc, plastikowe przybory laboratoryjne

Wybierz odpowiednie pojemniki dla każdego typu próbki; dokładnie oczyścić

Odczynniki

Odczynniki inne niż chromatograficzne

Należy używać odczynników o czystości chromatograficznej, o wysokiej czystości lub o czystości analitycznej


Przygotowanie roztworu standardowego

  • Najpierw przygotuj roztwór wzorca wewnętrznego; użyj tej samej partii w standardach i próbkach, aby zmniejszyć błędy
  • Substancje muszą mieć jakość chromatograficzną i być stabilne
  • Roztwory wzorcowe przechowywać w brązowych butelkach w niskiej temperaturze
  • W przypadku witamin należy używać brązowych kolb miarowych lub chronić przed światłem


Typowe problemy związane z obróbką wstępną próbek i ich rozwiązywaniem

Problem

Przyczyna

Rozwiązanie

Niepowiązane piki na chromatogramie

Zanieczyszczenie filtra

  1. Zanurz filtr w rozpuszczalniku próbki i wykonaj iniekcję próbną

  2. Zmień typ filtra

  3. Stosuj alternatywne techniki czyszczenia

Niska odpowiedź szczytowa (szczególnie próbki o niskim stężeniu)

Adsorpcja na powierzchni filtra

  1. Zmień typ filtra

  2. Przetwarzaj wszystkie próbki w tych samych warunkach

  3. Stosuj alternatywne techniki czyszczenia

Niski poziom odzysku

Niekompletna ekstrakcja

  1. Wydłuż czas ekstrakcji, użyj gorącego rozpuszczalnika

  2. Dostosuj metodę czyszczenia

Rozszerzone piki, skrócona żywotność kolumny

Zakłócenia i zanieczyszczenie próbki

Ulepsz metodę czyszczenia

Słaba precyzja

Niepełny powrót do zdrowia

  1. Zoptymalizuj lub zastąp derywatyzację, separację, ekstrakcję lub inne warunki

  2. Użyj automatycznej obsługi, aby poprawić precyzję

Zapytanie