Algumas amostras ainda não podem ser injetadas diretamente após o pré-tratamento. A derivatização é necessária para produzir compostos sem absorção de UV ou fluorescência detectáveis por detectores de UV ou de fluorescência.

Melhora a sensibilidade
Melhora a separação (mudança de qualidade)

Possíveis problemas incluem perda de amostra, contaminação, reações incompletas ou múltiplos subprodutos, que podem afetar a precisão ou introduzir erros.

Filtragem de Amostras

As amostras de LC devem ser uniformes e isentas de partículas; partículas podem danificar o injetor ou bloquear a coluna. As etapas incluem:

Agite a amostra antes da injeção e verifique se há partículas, turbidez ou emulsões
Se forem observadas partículas, filtre a amostra usando uma membrana que possa reter partículas ≥0,15 μm

Problemas potenciais: contaminação da amostra, adsorção que reduz a concentração do componente e evaporação do solvente causando erros.

Métodos de Extração

A extração separa os analitos dos co-solventes ou remove substâncias interferentes (por exemplo, proteínas). Os solventes orgânicos devem ser de baixa toxicidade, voláteis, com baixo teor de impurezas e dissolver bem a amostra.

Solventes comuns: éter dietílico, acetato de etila, diclorometano, clorofórmio, benzeno ou misturas.

Após a extração, as amostras podem ser injetadas diretamente ou concentradas para aumentar a concentração e a sensibilidade do analito.

Extração de amostras solúveis em água

Componentes ácidos e sais: extrair impurezas com solvente orgânico, ajustar para ácido e depois extrair ou injetar; ou secar sob N₂ e dissolver em solvente apropriado antes da injeção.
Componentes básicos e sais: extrair impurezas com solvente orgânico, ajustar para básico e depois extrair ou injetar; ou secar sob N₂ e dissolver em solvente apropriado antes da injeção.
Componentes neutros: extrair as impurezas com solvente orgânico e depois analisar diretamente por cromatografia de fase reversa.

Extração de amostras solúveis em gordura

Extrair com solvente orgânico ou injetar diretamente; ou secar sob N₂ e dissolver em solvente apropriado antes da injeção.

Fontes de Contaminação

Potenciais fontes de contaminação em análise:

Tipo de contaminação	Fonte	Medidas de Prevenção
Ambiental	Gases nocivos, poeira, aerossóis	Mantenha a sala de instrumentos isolada e limpa; instalar AC; controlar umidade <70%; evitar umidade, corrosão, vibração
Recipientes	Materiais de laboratório de vidro, cerâmica, quartzo e plástico	Selecione recipientes apropriados por tipo de amostra; limpe bem
Reagentes	Reagentes de grau não cromatográfico	Use reagentes de grau cromatográfico, de alta pureza ou de grau analítico

Preparação de solução padrão

Prepare primeiro a solução padrão interna; use o mesmo lote em padrões e amostras para reduzir erros
As substâncias devem ser de qualidade cromatográfica e estáveis
Armazene soluções padrão em frascos marrons em baixa temperatura
Para vitaminas, usar frascos volumétricos marrons ou proteger da luz

Problemas comuns no pré-tratamento e soluções de amostras

Problema	Causa	Solução
Picos não relacionados no cromatograma	Contaminação do filtro	Mergulhe o filtro no solvente da amostra e teste a injeção Alterar tipo de filtro Use técnicas de limpeza alternativas
Resposta de pico baixo (especialmente amostras de baixa concentração)	Adsorção na superfície do filtro	Alterar tipo de filtro Processe todas as amostras nas mesmas condições Use técnicas de limpeza alternativas
Baixa recuperação	Extração incompleta	Aumente o tempo de extração, use solvente quente Ajustar o método de limpeza
Picos ampliados, vida útil da coluna reduzida	Interferência e contaminação da amostra	Melhorar o método de limpeza
Má precisão	Recuperação incompleta	Otimizar ou substituir derivatização, separação, extração ou outras condições Use o manuseio automatizado para melhorar a precisão

Efeitos de temperatura extremamente alta/baixa e exposição à luz na estabilidade da amostra: teoria e metodologia

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