Освоение потока: руководство для ветеранов лабораторий по мобильным фазам ВЭЖХ

Введение

Я был там же, где и вы: смотрел на монитор в 2 часа ночи, наблюдая, как базовая линия дрейфует, как затерянная лодка в море, и задавался вопросом, не была ли «ВЭЖХ-засос» изобретена только для того, чтобы проверить мое здравомыслие. Если вы в бреду, пытаясь осмыслить высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), сделайте вдох. Это не просто коробка с дорогими деталями; это тонкий танец между химией и физикой.

В лаборатории мы часто говорим, что подвижная фаза — это «линия жизни» системы. Без него ваш образец просто останется в инжекторе и никуда не пойдет. Но как выбрать правильный «поезд», который доставит молекулы к детектору? Давайте разберемся, как будто мы болтаем за чашкой кофе в комнате отдыха.

1. Что такое ВЭЖХ на самом деле?

По своей сути ВЭЖХ – это разделение. Думайте об этом как о забеге, где «трасса» — это стационарная фаза (столбец), а «ветер», подталкивающий бегунов, — это подвижная фаза ВЭЖХ.

Волшебство происходит потому, что разные молекулы имеют разное «сродство». Некоторым молекулам нравится подвижная фаза, и они перемещаются по колонке. Другие «прилипчивы» — зациклены на стационарной фазе и отстают. Эта разница в скорости и создает пики на вашей хроматограмме.

2. Нормальная фаза против обратной фазы

Обычно именно здесь все начинают рвать на себе волосы. За годы своей практики я обнаружил, что самый простой способ запомнить это — посмотреть на полярность.

А. Нормально-фазовая хроматография

Это путь «старой школы». В нормально-фазовой хроматографии неподвижная фаза является полярной — думайте о ней как о магните для полярных молекул. Подвижная фаза, которую мы здесь используем, неполярна и обычно представляет собой растворители, такие как гексан или гептан.

• Логика: полярные «липкие» молекулы удерживаются полярным столбом. Неполярные молекулы быстро вымываются вместе с неполярной подвижной фазой.

• Совет для профессионалов: если вы увеличите полярность подвижной фазы (добавив немного изопропанола), ваши образцы будут двигаться быстрее.

Б. Обратно-фазовая хроматография.

Сегодня это золотой стандарт. Вероятно, 90% работы, которую я делаю в лаборатории, связана с обращенно-фазовой хроматографией. Здесь мы переворачиваем сценарий. Колонка неполярна (гидрофобна, как масло), а подвижная фаза полярна (обычно смесь воды и метанола или ацетонитрила).

• Логика: водолюбивые (полярные) молекулы проносятся вперед, потому что ненавидят маслянистый столб. Жиролюбивые (неполярные) молекулы прилипают к колонке, как клей.

• Почему нам это нравится: он предсказуем, универсален и использует растворители на водной основе, с которыми легче обращаться.

3. «Золотое правило» качества растворителей.

Вы не зря увидите на этикетках «Класс ВЭЖХ». Даже не думайте об использовании класса ACS или чего-то меньшего. Почему? Потому что эти «крошечные» примеси в растворителях более низкого качества со временем будут накапливаться в вашей колонке, снижая разрешение и создавая странные призрачные пики.

Всегда используйте воду сорта Milli-Q (18,2 МОм·см). Если ваша вода «грязная», ваша исходная линия будет выглядеть как горный хребет, и вы потратите три дня, пытаясь понять, почему.

4. Дегазация и фильтрация: убийцы производительности

Воздух – враг мобильной фазы ВЭЖХ. При нормальном давлении воздух растворяется в растворителях. Но как только растворитель попадает в насос, эти крошечные пузырьки могут попасть в обратные клапаны или ячейку детектора.

• Результат: колебания скорости потока, пульсация базовой линии и изменение времени удерживания.

• Решение: используйте встроенные дегазаторы или ультразвуковую\/вакуумную фильтрацию, если вы проводите высокочувствительные анализы.

Фильтрация не является обязательной. Даже растворители класса ВЭЖХ могут содержать микроскопические частицы, оставшиеся в результате производственного процесса или от крышки бутылки. Всегда фильтруйте через мембрану 0,22 мкм или 0,45 мкм, прежде чем она коснется резервуара. Это 5-минутное задание, способное спасти вашу колонку от преждевременной смерти.

5. Буферы и стеклянная ловушка

В обращенно-фазовой хроматографии мы используем буферы для поддержания стабильности pH ионизируемых образцов.

• Совет для профессионалов: если вы сегодня использовали буфер, промойте систему чистой водой/органической смесью, прежде чем идти домой. Если вы этого не сделаете, эти соли кристаллизуются и разрушат уплотнения вашего насоса.

• Стеклянная ловушка: Знаете ли вы, что если pH подвижной фазы вашей ВЭЖХ > 8,0, она действительно может выщелачивать ионы металлов из стеклянных резервуаров? В таких случаях перейдите на контейнеры из нержавеющей стали или специального пластика.

Давайте сделаем ваше разделение идеальным

Правильное использование мобильной фазы — это 80% успеха в ВЭЖХ. Если вы боретесь с базовыми показателями «ворсистого ковра», скачками давления или противоречивыми результатами, не тратьте еще один день на догадки.

Я провел тысячи часов за решением именно этих проблем. Я всегда рад поделиться «проверенными в лаборатории» советами, которые помогут вернуть ваш проект в нужное русло.

• Вацап: 86 18338832256

• Электронная почта:boonemi@aijirenvial.com
  

Ссылки

• Снайдер, Л.Р., Киркланд, Дж.Дж., и Долан, Дж.В. (2011). Введение в современную жидкостную хроматографию. 3-е издание. Джон Уайли и сыновья. («Золотой стандарт» для понимания механизмов разделения ВЭЖХ).

• Долан, JW (2002). «Приготовление подвижной фазы». LCGC Северная Америка, Серия по устранению неполадок. (Основное практическое руководство по дегазации и фильтрации).

• Апарисио, Р. (ред.). (2013). Руководство по оптимизации ВЭЖХ. Эльзевир. (Исчерпывающие данные о полярности растворителя и выборе буфера в обращенно-фазовой хроматографии).

• Аджилент Технологии. «Руководство по устранению неполадок системы ВЭЖХ: предотвращение распространенных ошибок подвижной фазы». Библиотека технических ресурсов.

• Корпорация Уотерс. «Принципы хроматографии: нормальная фаза и обратная фаза». Серия «Образование».

• Международная конференция по гармонизации (ICH). Q2(R1) Валидация аналитических процедур: текст и методология. (Стандарт для количественного определения площади пика и стабильности времени удерживания).