Mastering the Flow: Sprievodca laboratórnych veteránov k mobilným fázam HPLC

Úvod

Bol som tam, kde ste vy – o 2:00 som civel na monitor, sledoval som unášanie základnej čiary ako stratená loď na mori a premýšľal som, či „HPLC doo-hickey“ nebol vynájdený len preto, aby otestoval môj zdravý rozum. Ak sa pri pokuse omotať hlavu vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) cítite v delíriu, nadýchnite sa. Nie je to len krabica drahých dielov; je to jemný tanec medzi chémiou a fyzikou.

V laboratóriu často hovoríme, že mobilná fáza je „líniou života“ systému. Bez nej vaša vzorka len sedí v injektore a nikam nevedie. Ako si však vybrať ten správny „vlak“, ktorý prenesie vaše molekuly k detektoru? Poďme si to rozobrať, ako keby sme sa rozprávali pri káve v oddychovej miestnosti.

1. Čo je to vlastne HPLC?

Vo svojom jadre je HPLC o separácii. Predstavte si to ako preteky, kde „trať“ je stacionárna fáza (stĺpec) a „vietor“, ktorý tlačí bežcov pozdĺž, je mobilná fáza HP.

Kúzlo sa deje, pretože rôzne molekuly majú rôzne „afinity“. Niektoré molekuly milujú mobilnú fázu a približujú stĺpec. Iní sú „lepkaví“ – sú zamilovaní do stacionárnej fázy a zaostávajú. Tento rozdiel v rýchlosti je to, čo vytvára tieto píky na vašom chromatograme.

2. Normálna fáza vs. Reverzná fáza

To je zvyčajne miesto, kde si každý začne vyťahovať vlasy. Počas rokov praxe som zistil, že najjednoduchší spôsob, ako si to zapamätať, je pozrieť sa na polaritu.

A. Normálna fázová chromatografia

Toto je spôsob „starej školy“. V chromatografii s normálnou fázou je stacionárna fáza polárna – predstavte si ju ako magnet na polárne molekuly. Mobilná fáza, ktorú tu používame, je nepolárna, zvyčajne rozpúšťadlá ako hexán alebo heptán.

• Logika: Polárne "lepkavé" molekuly sú zadržiavané polárnym stĺpcom. Nepolárne molekuly sa rýchlo vymývajú s nepolárnou mobilnou fázou.

• Profesionálny tip: Ak zvýšite polaritu svojej mobilnej fázy (pridaním trochy izopropanolu), vaše vzorky sa budú skutočne pohybovať rýchlejšie.

B. Chromatografia s reverznou fázou

Dnes je to zlatý štandard. Pravdepodobne 90% práce, ktorú robím v laboratóriu, zahŕňa chromatografiu na reverznej fáze. Tu prevrátime scenár. Kolóna je nepolárna (hydrofóbna, ako olej) a mobilná fáza je polárna (zvyčajne zmes vody a metanolu alebo acetonitrilu).

• Logika: Vodu milujúce (polárne) molekuly sa priblížia, pretože nenávidia mastný stĺpec. Tukomilné (nepolárne) molekuly sa lepia na stĺpec ako lepidlo.

• Prečo ho milujeme: Je predvídateľný, všestranný a používa rozpúšťadlá na báze vody, ktoré sa ľahšie spravujú.

3. „Zlaté pravidlo“ kvality rozpúšťadiel

Z nejakého dôvodu sa na štítkoch zobrazí „Kvalita HPLC“. Ani neuvažujte o použití triedy ACS alebo niečoho menej. prečo? Pretože tie "drobné" nečistoty v rozpúšťadlách nižšej kvality sa časom nahromadia na vašom stĺpci, zabíjajú vaše rozlíšenie a vytvárajú čudné duchovné vrcholy.

Vždy používajte vodu čistoty Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Ak je vaša voda „špinavá“, vaša základná línia bude vyzerať ako pohorie a tri dni sa budete snažiť zistiť prečo.

4. Odplynenie a filtrácia: zabijaci výkonu

Vzduch je nepriateľom mobilnej fázy hplc. Pri normálnom tlaku sa vzduch rozpúšťa vo vašich rozpúšťadlách. Ale akonáhle toto rozpúšťadlo zasiahne čerpadlo, tieto malé bublinky sa môžu zachytiť v spätných ventiloch alebo detekčnej cele.

• Výsledok: Kolísanie prietoku, pulzujúce základné línie a pohyblivé retenčné časy.

• Oprava: Ak vykonávate testy s vysokou citlivosťou, použite vstavané odplyňovače alebo sonifikáciu\/vákuovú filtráciu.

Filtrácia nie je voliteľná. Dokonca aj rozpúšťadlá HPLC môžu mať mikroskopické častice z výrobného procesu alebo uzáveru fľaše. Vždy prefiltrujte cez 0,22 µm alebo 0,45 µm membránu predtým, ako sa dotkne vášho zásobníka. Je to 5-minútová úloha, ktorá môže zachrániť váš stĺpec pred predčasnou smrťou.

5. Nárazníky a sklenená pasca

V chromatografii na reverznej fáze používame pufre na udržanie stabilného pH pre ionizovateľné vzorky.

• Tip pre profesionálov: Ak ste dnes použili tlmivý roztok, pred odchodom domov umyte systém čistou vodou\/organickou zmesou. Ak to neurobíte, tieto soli vykryštalizujú a roztrhnú tesnenia čerpadla.

• Sklenená pasca: Vedeli ste, že ak je pH vašej mobilnej fázy hplc > 8,0, môže skutočne vylúhovať kovové ióny zo sklenených nádrží? V týchto prípadoch prejdite na nerezové alebo špeciálne plastové nádoby.

Postaráme sa o dokonalé odlúčenie

Správne nastavenie mobilnej fázy je v HPLC 80 % úspechu. Ak zápasíte so základnými líniami, tlakovými skokmi alebo nekonzistentnými výsledkami, nestrácajte ďalší deň hádaním.

Strávil som tisíce hodín pri riešení týchto konkrétnych problémov. Vždy sa rád podelím o trochu „laboratórne overených“ rád, aby sa váš projekt dostal späť na správnu cestu.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Email:boonemi@aijirenvial.com
  

Referencie

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Úvod do modernej kvapalinovej chromatografie. 3. vydanie. John Wiley & Sons. („Zlatý štandard“ na pochopenie separačných mechanizmov HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Príprava mobilnej fázy." LCGC Severná Amerika, Séria na riešenie problémov. (Základná praktická príručka pre odplyňovanie a filtráciu).

• Aparicio, R. (ed.). (2013). Manuál optimalizácie HPLC. Elsevier. (Komplexné údaje o polarite rozpúšťadla a výbere pufra v chromatografii na reverznej fáze).

• Agilent Technologies. "Príručka na riešenie problémov so systémom HPLC: Predchádzanie bežným chybám mobilnej fázy." Knižnica technických zdrojov.

• Waters Corporation. "Princípy chromatografie: normálna fáza vs. reverzná fáza." Vzdelávacia séria.

• Medzinárodná konferencia o harmonizácii (ICH). Q2(R1) Validácia analytických postupov: Text a metodika. (Štandard pre kvantifikáciu plochy píku a stabilitu retenčného času).