Obvladovanje toka: Vodnik za laboratorijske veterane za mobilne faze HPLC

Uvod

Bil sem tam, kjer ste vi – buljil sem v monitor ob 2. uri zjutraj, opazoval, kako se izhodiščna črta premika kot izgubljena ladja na morju, in se spraševal, ali je bil "HPLC doo-hickey" izumljen samo zato, da preizkusi moj razum. Če se počutite v deliriju, ko poskušate oviti glavo okoli tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), vdihnite. To ni le škatla dragih delov; to je občutljiv ples med kemijo in fiziko.

V laboratoriju pogosto rečemo, da je mobilna faza "življenjska linija" sistema. Brez tega vaš vzorec le sedi v injektorju in ne gre nikamor. Toda kako izbrati pravi "vlak", ki bo pripeljal vaše molekule do detektorja? Razčlenimo to, kot da klepetamo ob kavi v sobi za odmor.

1. Kaj v resnici je HPLC?

HPLC je v svojem bistvu ločevanje. Pomislite na to kot na dirko, kjer je "steza" stacionarna faza (steber), "veter", ki potiska tekače, pa je hplc mobilna faza.

Čarovnija se zgodi, ker imajo različne molekule različne "afinitete". Nekatere molekule obožujejo mobilno fazo in se premikajo skozi stolpec. Drugi so "lepljivi" - zaljubljeni so v stacionarno fazo in zaostajajo. Ta razlika v hitrosti ustvarja te vrhove na vašem kromatogramu.

2. Normalna faza proti obratni fazi

Običajno si vsi začnejo puliti lase. V letih svoje prakse sem ugotovil, da si to najlažje zapomnim tako, da pogledam polarnost.

A. Normalna fazna kromatografija

To je način "stare šole". V običajni fazni kromatografiji je stacionarna faza polarna – predstavljajte si jo kot magnet za polarne molekule. Mobilna faza, ki jo uporabljamo tukaj, je nepolarna, običajno topila, kot sta heksan ali heptan.

• Logika: polarne "lepljive" molekule zadrži polarni stolpec. Nepolarne molekule se hitro izperejo z nepolarno mobilno fazo.

• Strokovni nasvet: če povečate polarnost vaše mobilne faze (dodate malo izopropanola), se bodo vaši vzorci dejansko premikali hitreje.

B. Reverzno fazna kromatografija

Danes je to zlati standard. Verjetno 90 % dela, ki ga opravljam v laboratoriju, vključuje reverzno fazno kromatografijo. Tukaj obrnemo scenarij. Kolona je nepolarna (hidrofobna, kot olje), mobilna faza pa je polarna (običajno mešanica vode in metanola ali acetonitrila).

• Logika: (polarne) molekule, ki ljubijo vodo, se približujejo, ker sovražijo mastni stolpec. Maščobe (nepolarne) molekule se prilepijo na kolono kot lepilo.

• Zakaj ga imamo radi: je predvidljiv, vsestranski in uporablja topila na vodni osnovi, ki jih je lažje upravljati.

3. "Zlato pravilo" kakovosti topil

Na etiketah boste z razlogom videli "HPLC Grade". Niti ne pomislite na uporabo razreda ACS ali česar koli manj. Zakaj? Ker se bodo te "drobne" nečistoče v topilih nižje stopnje sčasoma nabrale na vašem stolpcu, zmanjšale vašo ločljivost in ustvarile nenavadne meglene vrhove.

Vedno uporabljajte vodo razreda Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Če je vaša voda "umazana", bo vaša osnovna linija videti kot gorovje in tri dni boste poskušali ugotoviti, zakaj.

4. Odplinjevanje in filtracija: ubijalca učinkovitosti

Zrak je sovražnik mobilne faze HPLC. Pri normalnem tlaku se zrak raztopi v vaših topilih. Ko pa to topilo zadene črpalko, se lahko ti drobni mehurčki ujamejo v povratne ventile ali detektorsko celico.

• Rezultat: nihanja pretoka, utripajoče osnovne črte in premikajoči se zadrževalni časi.

• Popravek: Če izvajate visoko občutljive teste, uporabite vgrajene razplinjevalce ali ultrazvočno\/vakuumsko filtracijo.

Filtracija ni izbirna. Celo topila stopnje HPLC imajo lahko mikroskopske delce iz proizvodnega procesa ali pokrovčka steklenice. Vedno filtrirajte skozi membrano 0,22 µm ali 0,45 µm, preden se dotakne vašega rezervoarja. To je 5-minutna naloga, ki lahko vašo kolumno reši pred prezgodnjo smrtjo.

5. Odbojniki in steklena past

Pri kromatografiji z reverzno fazo uporabljamo pufre, ki ohranjajo stabilen pH za ionizirajoče vzorce.

• Profesionalni nasvet: če ste danes uporabili pufer, pred odhodom domov sperite sistem s čisto vodo\/organsko mešanico. Če tega ne storite, bodo te soli kristalizirale in raztrgale tesnila vaše črpalke.

• Steklena past: Ali ste vedeli, da če je pH vaše mobilne faze HPLC > 8,0, lahko dejansko izpira kovinske ione iz steklenih rezervoarjev? V teh primerih preklopite na posode iz nerjavečega jekla ali posebne plastične posode.

Naj bo vaša ločitev popolna

Pravilna mobilna faza je 80 % bitke pri HPLC. Če se spopadate z izhodiščnimi črtami "dlakave preproge", skoki pritiska ali nedoslednimi rezultati, ne izgubljajte več dneva z ugibanjem.

Na tisoče ur sem preživel pri odpravljanju teh natančnih težav. Vedno z veseljem delim nekaj "laboratorijsko preizkušenih" nasvetov, da se vaš projekt vrne na pravo pot.

• WhatsApp: 86 18338832256

• E-pošta:boonemi@aijirenvial.com
  

Reference

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. in Dolan, J. W. (2011). Uvod v sodobno tekočinsko kromatografijo. 3. izdaja. John Wiley & Sons. ("Zlati standard" za razumevanje mehanizmov ločevanja HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Priprava mobilne faze." LCGC Severna Amerika, serija odpravljanja težav. (Osnovni praktični vodnik za razplinjevanje in filtracijo).

• Aparicio, R. (ur.). (2013). Priročnik za optimizacijo HPLC. Elsevier. (Celoviti podatki o polarnosti topila in izbiri pufra pri reverzno fazni kromatografiji).

• Agilent Technologies. "Vodnik za odpravljanje težav s sistemom HPLC: izogibanje pogostim napakam mobilne faze." Knjižnica tehničnih virov.

• Waters Corporation. "Principi kromatografije: normalna faza proti reverzni fazi." Izobraževalna serija.

• Mednarodna konferenca o harmonizaciji (ICH). Q2(R1) Validacija analitičnih postopkov: besedilo in metodologija. (Standard za kvantifikacijo površine vrha in stabilnost retenzijskega časa).