Zotërimi i rrjedhës: Udhëzuesi i veteranit të laboratorit për fazat e lëvizshme të HPLC

Hyrje

Unë kam qenë aty ku jeni - duke parë një monitor në orën 2 të mëngjesit, duke parë një lëvizje bazë si një varkë e humbur në det, duke pyetur veten nëse "HPLC doo-hickey" u shpik vetëm për të testuar mendjen time. Nëse ndiheni në delirim duke u përpjekur të mbështillni kokën rreth kromatografisë së lëngshme me performancë të lartë (HPLC), merrni frymë. Nuk është vetëm një kuti me pjesë të shtrenjta; është një kërcim delikat mes kimisë dhe fizikës.

Në laborator, ne shpesh themi se faza e lëvizshme është "linja e jetës" e sistemit. Pa të, kampioni juaj është thjesht i ulur në një injeksion, duke mos shkuar askund. Por si të zgjidhni "trenin" e duhur për të çuar molekulat tuaja në detektor? Le ta zbërthejmë sikur po bisedojmë me një kafe në dhomën e pushimit.

1. Çfarë është në të vërtetë HPLC?

Në thelbin e tij, HPLC ka të bëjë me ndarjen. Mendoni për atë si një garë ku "pista" është faza e palëvizshme (kolona) dhe "era" që shtyn vrapuesit përgjatë është faza e lëvizshme hplc.

Magjia ndodh sepse molekula të ndryshme kanë "afinitete" të ndryshme. Disa molekula e duan fazën e lëvizshme dhe zmadhojnë kolonën. Të tjerat janë "ngjitëse" - ata janë të interesuar në fazën e palëvizshme dhe mbeten prapa. Ky ndryshim në shpejtësi është ajo që krijon ato maja në kromatogramin tuaj.

2. Faza normale kundrejt fazës së kundërt

Zakonisht këtu të gjithë fillojnë të shkulin flokët. Në vitet e mia të praktikës, kam gjetur mënyrën më të lehtë për ta kujtuar këtë është duke parë polaritetin.

A. Kromatografia e Fazës Normale

Kjo është mënyra e "shkollës së vjetër". Në kromatografinë e fazës normale, faza e palëvizshme është polare - mendoni për atë si një magnet për molekulat polare. Faza e lëvizshme që përdorim këtu është jopolare, zakonisht tretës si heksani ose heptani.

• Logjika: Molekulat "ngjitëse" polare mbahen prapa nga kolona polare. Molekulat jopolare lahen shpejt me fazën e lëvizshme jopolare.

• Këshillë Pro: Nëse rritni polaritetin e fazës tuaj celular (duke shtuar pak izopropanol), mostrat tuaja në fakt do të lëvizin më shpejt.

B. Kromatografia me fazë të kundërt

Sot, ky është standardi i arit. Ndoshta 90% e punës që bëj në laborator përfshin kromatografinë e fazës së kundërt. Këtu, ne e kthejmë skenarin. Kolona është jopolare (hidrofobike, si vaji), dhe faza e lëvizshme është polare (zakonisht një përzierje uji dhe metanoli ose acetonitrili).

• Logjika: Molekulat (polare) që duan ujin zmadhohen sepse e urrejnë kolonën me vaj. Molekulat dhjamore (jo polare) ngjiten në kolonë si ngjitës.

• Pse e duam: Është i parashikueshëm, i gjithanshëm dhe përdor tretës me bazë uji të cilët janë më të lehtë për t'u menaxhuar.

3. "Rregulli i Artë" i Cilësisë së Tretësve

Do të shihni "Nota HPLC" në etiketa për një arsye. As mos mendoni për përdorimin e klasës ACS ose diçka më pak. Pse? Sepse ato papastërti "të vogla" në tretës të shkallës më të ulët do të grumbullohen në kolonën tuaj me kalimin e kohës, duke vrarë rezolucionin tuaj dhe duke krijuar maja të çuditshme fantazmë.

Përdorni gjithmonë ujë të klasës Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Nëse uji juaj është "i ndotur", vija juaj bazë do të duket si një varg malor dhe do të kaloni tre ditë duke u përpjekur të kuptoni pse.

4. Degazimi dhe filtrimi: Vrasësit e performancës

Ajri është armiku i fazës mobile të hplc. Nën presionin normal, ajri shpërndahet në tretësit tuaj. Por sapo ai tretës godet pompën, ato flluska të vogla mund të bllokohen në valvulat e kontrollit ose në qelizën e detektorit.

• Rezultati: Luhatjet e shkallës së rrjedhës, vijat bazë të pulsimit dhe koha e mbajtjes në lëvizje.

• Rregullimi: Përdorni degazues të integruar ose filtrim me sonik\/vakum nëse po kryeni analiza me ndjeshmëri të lartë.

Filtrimi nuk është fakultativ. Edhe tretësit e klasës HPLC mund të kenë grimca mikroskopike nga procesi i prodhimit ose nga tapa e shishes. Gjithmonë filtroni përmes një membrane 0,22µm ose 0,45µm përpara se të prekë rezervuarin tuaj. Është një detyrë 5-minutëshe që mund ta shpëtojë kolonën tuaj nga një vdekje e parakohshme.

5. Tamponët dhe kurthi i qelqit

Në kromatografinë e fazës së kundërt, ne përdorim tamponë për të mbajtur pH të qëndrueshme për mostrat e jonizueshme.

• Këshillë profesionale: Nëse keni përdorur një tampon sot, lani sistemin me ujë të pastër\/përzierje organike përpara se të shkoni në shtëpi. Nëse nuk e bëni këtë, ato kripëra do të kristalizohen dhe do të copëtojnë vulat e pompës tuaj.

• Kurthi i qelqit: A e dini se nëse pH e fazës celulare të hplc-së është > 8.0, ai në fakt mund të kullojë jonet metalike nga rezervuarët e qelqit? Në këto raste, kaloni në kontejnerë prej çeliku të pandryshkshëm ose plastike të specializuar.

Le ta bëjmë ndarjen tuaj perfekte

Marrja e duhur e fazës celulare është 80% e betejës në HPLC. Nëse jeni duke luftuar me linjat bazë të "qilim shag", rritje të presionit ose rezultate jokonsistente, mos humbisni një ditë tjetër duke hamendësuar.

Unë kam shpenzuar mijëra orë në stol për të zgjidhur këto probleme ekzakte. Unë jam gjithmonë i lumtur të ndaj pak këshilla "të vërtetuara nga laboratori" për ta rikthyer projektin tuaj në rrugën e duhur.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Email:boonemi@aijirenvial.com
  

Referencat

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Hyrje në kromatografinë moderne të lëngshme. Botimi i 3-të. John Wiley & Sons. ("Standardi i Artë" për të kuptuar mekanizmat e ndarjes së HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Përgatitja e fazës celulare". LCGC Amerika e Veriut, Seria e zgjidhjes së problemeve. (Udhëzues praktik thelbësor për degazimin dhe filtrimin).

• Aparicio, R. (Red.). (2013). Manuali i Optimizimit të HPLC. Elsevier. (Të dhëna gjithëpërfshirëse mbi polaritetin e tretësit dhe përzgjedhjen e buferit në kromatografinë me fazë të kundërt).

• Teknologjitë Agilente. "Udhëzues për zgjidhjen e problemeve të sistemit HPLC: Shmangia e gabimeve të zakonshme të fazës celulare." Biblioteka e Burimeve Teknike.

• Korporata Waters. "Parimet e kromatografisë: Faza normale kundër fazës së kundërt." Seria Edukimi.

• Konferenca Ndërkombëtare për Harmonizimin (ICH). Q2(R1) Validimi i Procedurave Analitike: Teksti dhe Metodologjia. (Standardi për sasinë e zonës së pikut dhe qëndrueshmërinë e kohës së mbajtjes).