పరిచయం
నేను మీరు ఉన్న చోటే ఉన్నాను—మధ్యాహ్నం 2 గంటలకు మానిటర్ వైపు చూస్తూ, సముద్రంలో తప్పిపోయిన పడవ వంటి బేస్లైన్ డ్రిఫ్ట్ని చూస్తున్నాను, నా తెలివిని పరీక్షించడానికి "HPLC డూ-హికీ" కనుగొనబడిందా అని ఆలోచిస్తున్నాను. హై పెర్ఫామెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) చుట్టూ మీ తలని చుట్టడానికి ప్రయత్నిస్తున్నట్లు మీకు మతిభ్రమించినట్లు అనిపిస్తే, శ్వాస తీసుకోండి. ఇది కేవలం ఖరీదైన భాగాల పెట్టె కాదు; ఇది కెమిస్ట్రీ మరియు ఫిజిక్స్ మధ్య ఒక సున్నితమైన నృత్యం.
ప్రయోగశాలలో, మొబైల్ దశ అనేది సిస్టమ్ యొక్క "లైఫ్ లైన్" అని మేము తరచుగా చెబుతాము. అది లేకుండా, మీ నమూనా కేవలం ఇంజెక్టర్లో కూర్చొని, ఎక్కడికీ వెళ్లదు. కానీ మీరు మీ అణువులను డిటెక్టర్కు తీసుకువెళ్లడానికి సరైన "రైలు"ని ఎలా ఎంచుకుంటారు? మనం బ్రేక్రూమ్లో కాఫీ తాగుతూ కబుర్లు చెప్పుకుంటున్నట్లుగా విడగొడదాం.
1. HPLC అంటే ఏమిటి, నిజంగా?
దాని ప్రధాన అంశంగా, HPLC వేరుగా ఉంటుంది. "ట్రాక్" అనేది స్టేషనరీ ఫేజ్ (కాలమ్) మరియు రన్నర్లను ముందుకు నడిపించే "గాలి" hplc మొబైల్ ఫేజ్ అయిన రేసు లాగా ఆలోచించండి.
వివిధ అణువులు వేర్వేరు "అనుబంధాలు" కలిగి ఉన్నందున మాయాజాలం జరుగుతుంది. కొన్ని అణువులు మొబైల్ దశను ఇష్టపడతాయి మరియు కాలమ్ ద్వారా జూమ్ చేస్తాయి. మరికొందరు "అంటుకునేవారు"-వారు నిశ్చల దశపై ప్రేమను కలిగి ఉంటారు మరియు వెనుకబడి ఉంటారు. వేగంలో ఈ వ్యత్యాసం మీ క్రోమాటోగ్రామ్లో ఆ శిఖరాలను సృష్టిస్తుంది.
2. సాధారణ దశ వర్సెస్ రివర్స్ ఫేజ్
ఇక్కడ సాధారణంగా ప్రతి ఒక్కరూ తమ జుట్టును బయటకు తీయడం ప్రారంభిస్తారు. నా సంవత్సరాల అభ్యాసంలో, ధ్రువణతను చూడటం ద్వారా దీన్ని గుర్తుంచుకోవడానికి సులభమైన మార్గాన్ని నేను కనుగొన్నాను.
A. సాధారణ దశ క్రోమాటోగ్రఫీ
ఇది "పాత పాఠశాల" మార్గం. సాధారణ దశ క్రోమాటోగ్రఫీలో, నిశ్చల దశ ధ్రువంగా ఉంటుంది-ఇది ధ్రువ అణువుల కోసం ఒక అయస్కాంతం వలె భావించండి. మేము ఇక్కడ ఉపయోగించే మొబైల్ దశ ధ్రువ రహితమైనది, సాధారణంగా హెక్సేన్ లేదా హెప్టేన్ వంటి ద్రావకాలు.
-
లాజిక్: పోలార్ "స్టిక్కీ" అణువులు ధ్రువ స్తంభం ద్వారా వెనక్కి తీసుకోబడతాయి. నాన్-పోలార్ మోలిక్యూల్స్ నాన్-పోలార్ మొబైల్ ఫేజ్తో త్వరగా కడిగివేయబడతాయి.
-
ప్రో చిట్కా: మీరు మీ మొబైల్ దశ యొక్క ధ్రువణతను పెంచినట్లయితే (కొంచెం ఐసోప్రొపనాల్ జోడించడం), మీ నమూనాలు వాస్తవానికి వేగంగా కదులుతాయి.
బి. రివర్స్ ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీ
నేడు, ఇది బంగారు ప్రమాణం. నేను ల్యాబ్లో చేసే పనిలో బహుశా 90% రివర్స్ ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీని కలిగి ఉంటుంది. ఇక్కడ, మేము స్క్రిప్ట్ను తిప్పాము. కాలమ్ నాన్-పోలార్ (హైడ్రోఫోబిక్, చమురు లాంటిది), మరియు ఫేజ్ మొబైల్ ధ్రువంగా ఉంటుంది (సాధారణంగా నీరు మరియు మిథనాల్ లేదా అసిటోనిట్రైల్ మిశ్రమం).
-
తర్కం: నీటిని ప్రేమించే (ధ్రువ) అణువులు జిడ్డుగల కాలమ్ను ద్వేషిస్తున్నందున జూమ్ చేస్తాయి. కొవ్వును ఇష్టపడే (నాన్-పోలార్) అణువులు జిగురులా కాలమ్కు అంటుకుంటాయి.
-
మేము దీన్ని ఎందుకు ఇష్టపడతాము: ఇది ఊహించదగినది, బహుముఖమైనది మరియు సులభంగా నిర్వహించగల నీటి ఆధారిత ద్రావకాలను ఉపయోగిస్తుంది.
3. సాల్వెంట్ నాణ్యత యొక్క "గోల్డెన్ రూల్"
మీరు కారణం కోసం లేబుల్లపై "HPLC గ్రేడ్"ని చూస్తారు. ACS గ్రేడ్ లేదా ఏదైనా తక్కువ ఉపయోగించడం గురించి కూడా ఆలోచించవద్దు. ఎందుకు? ఎందుకంటే తక్కువ-గ్రేడ్ ద్రావకాలలోని ఆ "చిన్న" మలినాలు కాలక్రమేణా మీ కాలమ్పై పేరుకుపోతాయి, మీ రిజల్యూషన్ను చంపి, విచిత్రమైన దెయ్యం శిఖరాలను సృష్టిస్తుంది.
ఎల్లప్పుడూ Milli-Q (18.2 MΩ.cm) గ్రేడ్ నీటిని ఉపయోగించండి. మీ నీరు "మురికిగా" ఉంటే, మీ బేస్లైన్ పర్వత శ్రేణిలా కనిపిస్తుంది మరియు ఎందుకు అని తెలుసుకోవడానికి మీరు మూడు రోజులు గడుపుతారు.
4. డీగ్యాసింగ్ మరియు ఫిల్ట్రేషన్: ది పెర్ఫార్మెన్స్ కిల్లర్స్
hplc మొబైల్ దశకు గాలి శత్రువు. సాధారణ ఒత్తిడిలో, గాలి మీ ద్రావకాలలో కరిగిపోతుంది. కానీ ఆ ద్రావకం పంపును తాకినప్పుడు, ఆ చిన్న బుడగలు చెక్ వాల్వ్లలో లేదా డిటెక్టర్ సెల్లో చిక్కుకోవచ్చు.
-
ఫలితం: ఫ్లో రేట్ హెచ్చుతగ్గులు, పల్సింగ్ బేస్లైన్లు మరియు కదిలే నిలుపుదల సమయాలు.
-
పరిష్కారము: మీరు అధిక-సున్నితత్వ పరీక్షలను అమలు చేస్తున్నట్లయితే అంతర్నిర్మిత డీగాసర్లు లేదా sonication\/వాక్యూమ్ ఫిల్ట్రేషన్ని ఉపయోగించండి.
వడపోత ఐచ్ఛికం కాదు. HPLC గ్రేడ్ ద్రావకాలు కూడా తయారీ ప్రక్రియ లేదా బాటిల్ క్యాప్ నుండి మైక్రోస్కోపిక్ కణాలను కలిగి ఉంటాయి. మీ రిజర్వాయర్ను తాకడానికి ముందు ఎల్లప్పుడూ 0.22µm లేదా 0.45µm మెమ్బ్రేన్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయండి. ఇది 5 నిమిషాల పని, ఇది మీ కాలమ్ను అకాల మరణం నుండి కాపాడుతుంది.
5. బఫర్లు మరియు గ్లాస్ ట్రాప్
రివర్స్ ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో, అయనీకరణం చేయగల నమూనాల కోసం pH స్థిరంగా ఉంచడానికి మేము బఫర్లను ఉపయోగిస్తాము.
-
ప్రో చిట్కా: మీరు ఈ రోజు బఫర్ని ఉపయోగించినట్లయితే, మీరు ఇంటికి వెళ్లే ముందు సిస్టమ్ను స్వచ్ఛమైన నీటితో\/ఆర్గానిక్ మిశ్రమంతో కడగాలి. మీరు చేయకపోతే, ఆ లవణాలు మీ పంపు ముద్రలను స్ఫటికీకరించి, ముక్కలు చేస్తాయి.
-
గ్లాస్ ట్రాప్: మీ హెచ్పిఎల్సి మొబైల్ ఫేజ్ pH> 8.0 అయితే, అది వాస్తవానికి గాజు రిజర్వాయర్ల నుండి మెటల్ అయాన్లను లీచ్ చేయగలదని మీకు తెలుసా? ఈ సందర్భాలలో స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ లేదా ప్రత్యేకమైన ప్లాస్టిక్ కంటైనర్లకు మారండి.
లెట్స్ గెట్ యువర్ సెపరేషన్ పర్ఫెక్ట్
మొబైల్ దశను సరిగ్గా పొందడం HPLCలో 80% యుద్ధం. మీరు "షాగ్ కార్పెట్" బేస్లైన్లు, ప్రెజర్ స్పైక్లు లేదా అస్థిరమైన ఫలితాలతో ఇబ్బంది పడుతుంటే, ఊహించి మరో రోజు వృధా చేయకండి.
ఈ ఖచ్చితమైన సమస్యలను పరిష్కరించడంలో నేను బెంచ్ వద్ద వేల గంటలు గడిపాను. మీ ప్రాజెక్ట్ను తిరిగి ట్రాక్లోకి తీసుకురావడానికి "ల్యాబ్-నిరూపితమైన" సలహాలను పంచుకోవడానికి నేను ఎల్లప్పుడూ సంతోషిస్తాను.
సూచనలు
-
స్నైడర్, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). ఆధునిక లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీకి పరిచయం. 3వ ఎడిషన్. జాన్ విలే & సన్స్. (HPLC విభజన విధానాలను అర్థం చేసుకోవడానికి "గోల్డ్ స్టాండర్డ్").
-
డోలన్, J. W. (2002). "మొబైల్ దశ తయారీ." LCGC ఉత్తర అమెరికా, ట్రబుల్షూటింగ్ సిరీస్. (డీగ్యాసింగ్ మరియు వడపోత కోసం అవసరమైన ప్రాక్టికల్ గైడ్).
-
అపారిసియో, R. (Ed.). (2013) HPLC ఆప్టిమైజేషన్ మాన్యువల్. ఎల్సెవియర్. (రివర్స్ ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో ద్రావణి ధ్రువణత మరియు బఫర్ ఎంపికపై సమగ్ర డేటా).
-
ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్. "HPLC సిస్టమ్ ట్రబుల్షూటింగ్ గైడ్: సాధారణ మొబైల్ దశ దోషాలను నివారించడం." సాంకేతిక వనరుల లైబ్రరీ.
-
వాటర్స్ కార్పొరేషన్. "ప్రిన్సిపల్స్ ఆఫ్ క్రోమాటోగ్రఫీ: నార్మల్ ఫేజ్ వర్సెస్ రివర్స్ ఫేజ్." విద్యా శ్రేణి.
-
ఇంటర్నేషనల్ కాన్ఫరెన్స్ ఆన్ హార్మోనైజేషన్ (ICH). Q2(R1) విశ్లేషణాత్మక విధానాల ధ్రువీకరణ: టెక్స్ట్ మరియు మెథడాలజీ. (పీక్ ఏరియా క్వాంటిఫికేషన్ మరియు రిటెన్షన్ టైమ్ స్టెబిలిటీకి స్టాండర్డ్).
ఇంగ్లీష్
చైనీస్
