การควบคุมการไหลอย่างเชี่ยวชาญ: คู่มือทหารผ่านศึกในห้องทดลองเกี่ยวกับเฟส HPLC Mobile

บทนำ

ฉันเคยไปในที่ที่คุณอยู่—จ้องมองที่มอนิเตอร์ตอนตี 2 ดูการล่องลอยของเส้นฐานเหมือนเรือที่หายไปในทะเล และสงสัยว่า "HPLC doo-hickey" ได้รับการประดิษฐ์ขึ้นเพื่อทดสอบสุขภาพจิตของฉันหรือไม่ หากคุณรู้สึกเพ้อเจ้อขณะพยายามใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) ให้หายใจเข้า ไม่ใช่แค่กล่องอะไหล่ราคาแพงเท่านั้น มันเป็นการเต้นรำที่ละเอียดอ่อนระหว่างเคมีและฟิสิกส์

ในห้องปฏิบัติการ เรามักพูดว่าระยะเคลื่อนที่คือ "เส้นชีวิต" ของระบบ หากไม่มีมัน ตัวอย่างของคุณก็จะนั่งอยู่ในหัวฉีดและไปไหนไม่ได้เลย แต่คุณจะเลือก "รถไฟ" ที่เหมาะสมเพื่อนำโมเลกุลของคุณไปยังเครื่องตรวจจับได้อย่างไร เรามาดูรายละเอียดกันเหมือนเรากำลังคุยกันเรื่องกาแฟอยู่ในห้องพักกันดีกว่า

1. HPLC คืออะไร จริงๆ แล้ว?

โดยแก่นแท้แล้ว HPLC นั้นเกี่ยวกับการแยกจากกัน คิดว่ามันเหมือนกับการแข่งขันที่ "ลู่วิ่ง" เป็นช่วงที่หยุดนิ่ง (เสา) และ "ลม" ที่ผลักนักวิ่งไปตามนั้นคือระยะเคลื่อนที่ของ hplc

ความมหัศจรรย์นี้เกิดขึ้นเพราะโมเลกุลที่ต่างกันมี "ความสัมพันธ์" ที่แตกต่างกัน โมเลกุลบางตัวชอบเฟสเคลื่อนที่และซูมผ่านคอลัมน์ คนอื่นๆ "เหนียว"—พวกเขาชอบช่วงที่อยู่กับที่และล้าหลัง ความเร็วที่แตกต่างกันนี้เป็นสิ่งที่สร้างจุดสูงสุดบนโครมาโตแกรมของคุณ

2. เฟสปกติกับเฟสย้อนกลับ

โดยปกติแล้วทุกคนจะเริ่มถอนผมออก ในช่วงหลายปีที่ผ่านมา ฉันพบวิธีที่ง่ายที่สุดในการจดจำสิ่งนี้คือการดูขั้ว

ก. โครมาโตกราฟีเฟสปกติ

นี่คือวิถี "โรงเรียนเก่า" ในโครมาโทกราฟีแบบเฟสปกติ เฟสที่อยู่นิ่งจะเป็นแบบขั้ว ลองคิดดูว่าเฟสนี้เหมือนกับแม่เหล็กสำหรับโมเลกุลเชิงขั้ว เฟสเคลื่อนที่ที่เราใช้ที่นี่ไม่ใช่ขั้ว โดยปกติจะเป็นตัวทำละลาย เช่น เฮกเซนหรือเฮปเทน

• ตรรกะ: โมเลกุล "เหนียว" เชิงขั้วถูกรั้งไว้โดยเสาขั้วโลก โมเลกุลที่ไม่มีขั้วจะถูกชะล้างออกอย่างรวดเร็วด้วยเฟสเคลื่อนที่ที่ไม่มีขั้ว

• เคล็ดลับสำหรับมือโปร: หากคุณเพิ่มขั้วของเฟสเคลื่อนที่ (เพิ่มไอโซโพรพานอลเล็กน้อย) ตัวอย่างของคุณจะเคลื่อนที่เร็วขึ้นจริงๆ

B. โครมาโตกราฟีแบบรีเวิร์สเฟส

วันนี้นี่คือมาตรฐานทองคำ งานที่ฉันทำในห้องปฏิบัติการน่าจะประมาณ 90% เกี่ยวข้องกับโครมาโตกราฟีแบบรีเวิร์สเฟส ที่นี่เราพลิกสคริปต์ คอลัมน์ไม่มีขั้ว (ไม่ชอบน้ำ เช่น น้ำมัน) และเฟสเคลื่อนที่เป็นแบบมีขั้ว (โดยปกติจะเป็นส่วนผสมของน้ำและเมทานอลหรืออะซิโตไนไตรล์)

• ตรรกะ: โมเลกุลที่รักน้ำ (มีขั้ว) ซูมเข้าไปเพราะพวกมันเกลียดคอลัมน์ที่มีน้ำมัน โมเลกุลที่ชอบไขมัน (ไม่มีขั้ว) จะเกาะติดกับคอลัมน์เหมือนกาว

• เหตุผลที่เราชื่นชอบ: เป็นสิ่งที่คาดเดาได้ ใช้งานได้หลากหลาย และใช้ตัวทำละลายแบบน้ำซึ่งง่ายต่อการจัดการ

3. "กฎทอง" ของคุณภาพตัวทำละลาย

คุณจะเห็น "เกรด HPLC" บนฉลากด้วยเหตุผลบางประการ อย่าคิดจะใช้เกรด ACS หรืออะไรที่น้อยกว่านี้ด้วยซ้ำ ทำไม เพราะสิ่งสกปรก "เล็กๆ" เหล่านั้นในตัวทำละลายเกรดต่ำจะสะสมในคอลัมน์ของคุณเมื่อเวลาผ่านไป ทำให้ความละเอียดของคุณลดลง และสร้างจุดสูงสุดที่แปลกประหลาด

ใช้น้ำเกรด Milli-Q (18.2 MΩ.cm) เสมอ หากน้ำของคุณ "สกปรก" เส้นฐานของคุณจะดูเหมือนทิวเขา และคุณจะใช้เวลาสามวันในการพยายามหาสาเหตุ

4. การไล่ก๊าซและการกรอง: นักฆ่าประสิทธิภาพ

อากาศเป็นศัตรูของเฟสมือถือ hplc ภายใต้ความดันปกติ อากาศจะละลายในตัวทำละลายของคุณ แต่เมื่อตัวทำละลายกระทบปั๊ม ฟองอากาศเล็กๆ เหล่านั้นอาจติดอยู่ในเช็ควาล์วหรือเซลล์เครื่องตรวจจับได้

• ผลลัพธ์: ความผันผวนของอัตราการไหล เส้นพื้นฐานที่เต้นเป็นจังหวะ และเวลากักเก็บที่เคลื่อนที่

• การแก้ไข: ใช้เครื่องไล่แก๊สในตัว หรือการกรอง sonication\/vacuum หากคุณใช้ชุดตรวจความไวสูง

การกรองไม่ใช่ทางเลือก แม้แต่ตัวทำละลายเกรด HPLC ก็อาจมีอนุภาคขนาดเล็กมากจากกระบวนการผลิตหรือฝาขวดได้ กรองผ่านเมมเบรนขนาด 0.22µm หรือ 0.45µm ก่อนที่จะสัมผัสกับอ่างเก็บน้ำของคุณเสมอ เป็นงาน 5 นาทีที่สามารถช่วยคอลัมน์ของคุณจากการตายก่อนวัยอันควร

5. บัฟเฟอร์และกับดักแก้ว

ในโครมาโทกราฟีแบบรีเวิร์สเฟส เราใช้บัฟเฟอร์เพื่อรักษา pH ให้คงที่สำหรับตัวอย่างที่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้

• เคล็ดลับสำหรับมือโปร: หากคุณใช้บัฟเฟอร์ในวันนี้ ให้ล้างระบบด้วยน้ำบริสุทธิ์\/ส่วนผสมออร์แกนิกก่อนกลับบ้าน ถ้าคุณไม่ทำ เกลือเหล่านั้นจะตกผลึกและฉีกซีลปั๊มของคุณ

• กับดักแก้ว: คุณรู้หรือไม่ว่าหาก pH ของเฟสเคลื่อนที่ของ hplc อยู่ที่ > 8.0 มันสามารถชะล้างไอออนของโลหะออกจากแหล่งเก็บแก้วได้จริง เปลี่ยนไปใช้ภาชนะสแตนเลสหรือพลาสติกเฉพาะในกรณีเหล่านี้

มาทำให้การแยกตัวของคุณสมบูรณ์แบบกันเถอะ

การทำให้เฟสเคลื่อนที่ถูกต้องคือ 80% ของการต่อสู้ใน HPLC หากคุณกำลังดิ้นรนกับเส้นฐาน "พรมขนหยาบ" แรงกดดันที่เพิ่มขึ้น หรือผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกัน อย่าเสียเวลาคาดเดาอีกวัน

ฉันใช้เวลาหลายพันชั่วโมงในการแก้ไขปัญหาเหล่านี้ ฉันยินดีเสมอที่จะแบ่งปันคำแนะนำที่ "ผ่านการพิสูจน์แล้วในห้องปฏิบัติการ" เพื่อให้โครงการของคุณกลับมาดำเนินการได้ตามปกติ

• วอทส์แอพพ์: 86 18338832256

• อีเมล์:boonemi@aijirenvial.com
  

อ้างอิง

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. และ Dolan, J. W. (2011) ความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับโครมาโตกราฟีของเหลวสมัยใหม่ ฉบับที่ 3. จอห์น ไวลีย์ แอนด์ ซันส์ ("มาตรฐานทองคำ" สำหรับการทำความเข้าใจกลไกการแยก HPLC)

• โดแลน, เจ. ดับบลิว. (2002). "การเตรียมเฟสเคลื่อนที่" LCGC อเมริกาเหนือ ซีรี่ส์การแก้ไขปัญหา (คู่มือปฏิบัติที่จำเป็นสำหรับการกำจัดก๊าซและการกรอง)

• Aparicio, R. (เอ็ด.). (2013) คู่มือการเพิ่มประสิทธิภาพ HPLC เอลส์เวียร์ (ข้อมูลที่ครอบคลุมเกี่ยวกับขั้วของตัวทำละลายและการเลือกบัฟเฟอร์ในโครมาโตกราฟีแบบรีเวิร์สเฟส)

• เทคโนโลยีเอจิเลนต์ "คู่มือการแก้ไขปัญหาระบบ HPLC: การหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดเกี่ยวกับเฟสเคลื่อนที่ทั่วไป" ห้องสมุดทรัพยากรทางเทคนิค

• วอเตอร์ส คอร์ปอเรชั่น "หลักการของโครมาโตกราฟี: เฟสปกติกับเฟสย้อนกลับ" ซีรี่ส์การศึกษา

• การประชุมนานาชาติเรื่องการประสานกัน (ICH) การตรวจสอบความถูกต้องของขั้นตอนการวิเคราะห์ในไตรมาสที่ 2 (R1): ข้อความและวิธีการ (มาตรฐานสำหรับการวัดปริมาณพื้นที่สูงสุดและความเสถียรของเวลากักเก็บ)