بہاؤ میں مہارت حاصل کرنا: HPLC موبائل فیز کے لیے ایک لیب ویٹرن گائیڈ

تعارف

میں وہیں گیا ہوں جہاں آپ ہیں — صبح 2 بجے ایک مانیٹر کو گھورتے ہوئے، سمندر میں کھوئی ہوئی کشتی کی طرح ایک بیس لائن ڈرفٹ دیکھ رہا تھا، سوچ رہا تھا کہ کیا "HPLC ڈو-ہکی" صرف میری عقل کو جانچنے کے لیے ایجاد کیا گیا تھا۔ اگر آپ اپنے سر کو ہائی پرفارمنس لیکویڈ کرومیٹوگرافی (HPLC) کے گرد لپیٹنے کی کوشش کر رہے ہیں تو ایک سانس لیں۔ یہ صرف مہنگے حصوں کا ایک ڈبہ نہیں ہے۔ یہ کیمسٹری اور فزکس کے درمیان ایک نازک رقص ہے۔

لیب میں، ہم اکثر کہتے ہیں کہ موبائل کا مرحلہ سسٹم کی "لائف لائن" ہے۔ اس کے بغیر، آپ کا نمونہ صرف ایک انجیکٹر میں بیٹھا ہے، کہیں نہیں جا رہا ہے. لیکن آپ اپنے مالیکیولز کو ڈیٹیکٹر تک لے جانے کے لیے صحیح "ٹرین" کا انتخاب کیسے کرتے ہیں؟ آئیے اسے اس طرح توڑ دیں جیسے ہم بریک روم میں کافی پر بات کر رہے ہوں۔

1. واقعی HPLC کیا ہے؟

اس کے مرکز میں، HPLC علیحدگی کے بارے میں ہے۔ اس کے بارے میں ایک دوڑ کی طرح سوچیں جہاں "ٹریک" اسٹیشنری مرحلہ (کالم) ہے اور "ہوا" دوڑنے والوں کو ساتھ لے کر چلنے والا hplc موبائل مرحلہ ہے۔

جادو اس لیے ہوتا ہے کہ مختلف مالیکیولز میں مختلف "وابستگی" ہوتی ہے۔ کچھ مالیکیولز موبائل فیز کو پسند کرتے ہیں اور کالم کے ذریعے زوم کرتے ہیں۔ دوسرے "چپچپا" ہوتے ہیں - وہ سٹیشنری مرحلے پر کچلتے ہیں اور پیچھے رہ جاتے ہیں۔ رفتار میں یہ فرق وہی ہے جو آپ کے کرومیٹوگرام پر ان چوٹیوں کو تخلیق کرتا ہے۔

2. نارمل فیز بمقابلہ ریورس فیز

عام طور پر یہ وہ جگہ ہے جہاں ہر کوئی اپنے بال نکالنا شروع کر دیتا ہے۔ اپنے برسوں کی مشق میں، میں نے اسے یاد رکھنے کا سب سے آسان طریقہ قطبیت کو دیکھ کر پایا ہے۔

A. نارمل فیز کرومیٹوگرافی۔

یہ "پرانے اسکول" کا طریقہ ہے۔ نارمل فیز کرومیٹوگرافی میں، سٹیشنری فیز قطبی ہوتا ہے — اسے قطبی مالیکیولز کے لیے مقناطیس کی طرح سمجھیں۔ ہم یہاں جو موبائل مرحلہ استعمال کرتے ہیں وہ غیر قطبی ہے، عام طور پر سالوینٹس جیسے ہیکسین یا ہیپٹین۔

• منطق: قطبی "چپچپا" مالیکیول قطبی کالم کے ذریعہ واپس پکڑے جاتے ہیں۔ غیر قطبی مالیکیول نان پولر موبائل فیز کے ساتھ جلدی سے دھل جاتے ہیں۔

• پرو ٹِپ: اگر آپ اپنے موبائل فیز کی قطبیت کو بڑھاتے ہیں (تھوڑا سا آئسوپروپانول شامل کرتے ہیں)، تو آپ کے نمونے درحقیقت تیزی سے آگے بڑھیں گے۔

B. ریورس فیز کرومیٹوگرافی۔

آج، یہ سونے کا معیار ہے۔ شاید میں لیب میں جو کام کرتا ہوں اس کا 90% ریورس فیز کرومیٹوگرافی پر مشتمل ہوتا ہے۔ یہاں، ہم سکرپٹ پلٹائیں. کالم غیر قطبی ہے (ہائیڈروفوبک، تیل کی طرح)، اور فیز موبائل قطبی ہے (عام طور پر پانی اور میتھانول یا ایسٹونیٹرائل کا مرکب)۔

• منطق: پانی سے محبت کرنے والے (قطبی) مالیکیول زوم ہوتے ہیں کیونکہ وہ تیل والے کالم سے نفرت کرتے ہیں۔ چربی سے محبت کرنے والے (غیر قطبی) مالیکیول کالم پر گوند کی طرح چپک جاتے ہیں۔

• ہم اسے کیوں پسند کرتے ہیں: یہ قابل قیاس، ورسٹائل ہے اور پانی پر مبنی سالوینٹس استعمال کرتا ہے جن کا انتظام کرنا آسان ہے۔

3. سالوینٹ کوالٹی کا "سنہری اصول"

آپ کو ایک وجہ سے لیبلز پر "HPLC گریڈ" نظر آئے گا۔ ACS گریڈ یا اس سے کم کچھ استعمال کرنے کے بارے میں بھی نہ سوچیں۔ کیوں؟ کیونکہ نچلے درجے کے سالوینٹس میں وہ "چھوٹی" نجاستیں وقت کے ساتھ ساتھ آپ کے کالم پر جمع ہوں گی، آپ کے ریزولوشن کو ختم کر دیں گی اور عجیب و غریب بھوت چوٹیاں پیدا کر دیں گی۔

ہمیشہ Milli-Q (18.2 MΩ.cm) گریڈ کا پانی استعمال کریں۔ اگر آپ کا پانی "گندا" ہے، تو آپ کی بنیاد ایک پہاڑی سلسلے کی طرح نظر آئے گی، اور آپ اس کی وجہ جاننے کی کوشش میں تین دن گزاریں گے۔

4. ڈیگاسنگ اور فلٹریشن: کارکردگی کے قاتل

ہوا hplc موبائل مرحلے کی دشمن ہے۔ عام دباؤ کے تحت، ہوا آپ کے سالوینٹس میں گھل جاتی ہے۔ لیکن ایک بار جب وہ سالوینٹ پمپ سے ٹکرا جاتا ہے، تو وہ چھوٹے بلبلے چیک والوز یا ڈیٹیکٹر سیل میں پھنس سکتے ہیں۔

• نتیجہ: بہاؤ کی شرح میں اتار چڑھاو، پلسنگ بیس لائنز، اور منتقلی برقرار رکھنے کے اوقات۔

• درست کریں: اگر آپ اعلیٰ حساسیت کی جانچ کر رہے ہیں تو بلٹ ان ڈیگاسرز، یا سونیکیشن\/ویکیوم فلٹریشن کا استعمال کریں۔

فلٹریشن اختیاری نہیں ہے۔ یہاں تک کہ HPLC گریڈ سالوینٹس میں بھی مینوفیکچرنگ کے عمل یا بوتل کے ڈھکن سے خوردبینی ذرات ہو سکتے ہیں۔ ہمیشہ 0.22µm یا 0.45µm جھلی کے ذریعے فلٹر کریں اس سے پہلے کہ یہ آپ کے ذخائر کو چھوئے۔ یہ 5 منٹ کا کام ہے جو آپ کے کالم کو قبل از وقت موت سے بچا سکتا ہے۔

5. بفرز اور گلاس ٹریپ

ریورس فیز کرومیٹوگرافی میں، ہم ionizable نمونوں کے لیے pH کو مستحکم رکھنے کے لیے بفرز کا استعمال کرتے ہیں۔

• پرو ٹِپ: اگر آپ نے آج بفر استعمال کیا ہے، تو گھر جانے سے پہلے سسٹم کو خالص پانی\/نامیاتی مکس سے دھو لیں۔ اگر آپ ایسا نہیں کرتے ہیں تو، وہ نمکیات آپ کے پمپ کی مہروں کو کرسٹلائز کر کے ٹکڑے ٹکڑے کر دیں گے۔

• شیشے کا جال: کیا آپ جانتے ہیں کہ اگر آپ کا hplc موبائل فیز pH> 8.0 ہے، تو یہ شیشے کے ذخائر سے دھاتی آئنوں کو درحقیقت نکال سکتا ہے؟ ان صورتوں میں سٹینلیس سٹیل یا خصوصی پلاسٹک کنٹینرز پر جائیں۔

آئیے آپ کی علیحدگی کامل کریں۔

HPLC میں موبائل فیز کو صحیح طریقے سے حاصل کرنا 80% جنگ ہے۔ اگر آپ "شگ کارپٹ" بیس لائنز، پریشر اسپائکس، یا متضاد نتائج کے ساتھ جدوجہد کر رہے ہیں، تو اندازہ لگانے میں ایک اور دن ضائع نہ کریں۔

میں نے ان عین مسائل کو حل کرنے میں بینچ پر ہزاروں گھنٹے گزارے ہیں۔ میں آپ کے پروجیکٹ کو دوبارہ پٹری پر لانے کے لیے تھوڑا سا "لیب سے ثابت شدہ" مشورہ دینے میں ہمیشہ خوش ہوں۔

• واٹس ایپ: 86 18338832256

• ای میل:boonemi@aijirenvial.com
  

حوالہ جات

• سنائیڈر، ایل آر، کرک لینڈ، جے جے، اور ڈولان، جے ڈبلیو (2011)۔ جدید مائع کرومیٹوگرافی کا تعارف۔ تیسرا ایڈیشن۔ جان ولی اینڈ سنز۔ (HPLC علیحدگی کے طریقہ کار کو سمجھنے کے لیے "گولڈ اسٹینڈرڈ")۔

• ڈولن، جے ڈبلیو (2002)۔ "موبائل مرحلے کی تیاری۔" LCGC شمالی امریکہ، ٹربل شوٹنگ سیریز۔ (ڈیگاسنگ اور فلٹریشن کے لیے ضروری عملی گائیڈ)۔

• Aparicio، R. (Ed.) (2013)۔ HPLC آپٹیمائزیشن کا دستی۔ ایلسیویئر۔ (ریورس فیز کرومیٹوگرافی میں سالوینٹ پولرٹی اور بفر سلیکشن پر جامع ڈیٹا)۔

• ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز۔ "HPLC سسٹم ٹربل شوٹنگ گائیڈ: موبائل فیز کی عام غلطیوں سے بچنا۔" ٹیکنیکل ریسورس لائبریری۔

• واٹر کارپوریشن۔ "Chromatography کے اصول: نارمل فیز بمقابلہ ریورس فیز۔" تعلیمی سلسلہ۔

• ہم آہنگی پر بین الاقوامی کانفرنس (ICH). Q2(R1) تجزیاتی طریقہ کار کی توثیق: متن اور طریقہ کار۔ (چوٹی کے علاقے کی مقدار اور برقرار رکھنے کے وقت کے استحکام کے لئے معیاری)۔