Oqimni o'zlashtirish: HPLC mobil bosqichlari bo'yicha laboratoriya faxriysi uchun qo'llanma

Kirish

Men siz turgan joyda bo‘ldim — tungi soat 2 da monitorga tikilib, dengizdagi yo‘qolgan qayiq kabi driftni tomosha qilib, “HPLC du-hickey” aql-idrokni sinab ko‘rish uchun ixtiro qilinganmi, deb hayron bo‘ldim. Agar yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) atrofida boshingizni o'rashga harakat qilayotganingizda aqldan ozgan bo'lsangiz, nafas oling. Bu shunchaki qimmatbaho qismlar qutisi emas; bu kimyo va fizika o'rtasidagi nozik raqs.

Laboratoriyada biz ko'pincha mobil faza tizimning "hayot chizig'i" deb aytamiz. Busiz, sizning namunangiz faqat injektorda o'tirib, hech qaerga ketmaydi. Ammo molekulalaringizni detektorga olib borish uchun to'g'ri "poezd" ni qanday tanlash mumkin? Keling, dam olish xonasida kofe ustida suhbatlashayotgandek, uni sindirib olaylik.

1. HPLC nima, haqiqatan ham?

Asosiysi, HPLC ajratish haqida. Buni poyga kabi o'ylab ko'ring, bu erda "trek" statsionar faza (ustun) va yuguruvchilarni itarib yuboradigan "shamol" hplc mobil bosqichidir.

Sehr-jodu turli molekulalar turli xil "yaqinliklarga" ega bo'lgani uchun sodir bo'ladi. Ba'zi molekulalar mobil fazani yaxshi ko'radilar va ustunni kattalashtiradilar. Boshqalari esa "yopishqoq" - ular statsionar fazani yaxshi ko'radilar va orqada qoladilar. Tezlikdagi bu farq sizning xromatogrammangizdagi cho'qqilarni yaratadi.

2. Oddiy faza va teskari faza

Odatda bu erda hamma sochlarini tortib olishni boshlaydi. Amaliyot yillarimda men buni eslab qolishning eng oson yo'lini qutblanishga qarab topdim.

A. Oddiy fazali xromatografiya

Bu "eski maktab" usuli. Oddiy fazali xromatografiyada statsionar faza qutblidir - uni qutbli molekulalar uchun magnit kabi o'ylab ko'ring. Bu erda biz foydalanadigan mobil faza qutbsiz, odatda geksan yoki geptan kabi erituvchilardir.

• Mantiq: qutbli "yopishqoq" molekulalar qutb ustuni tomonidan ushlab turiladi. Polar bo'lmagan molekulalar qutbsiz mobil faza bilan tezda yuviladi.

• Maslahat: Agar siz mobil fazangizning polaritesini oshirsangiz (bir oz izopropanol qo'shsangiz), namunalaringiz aslida tezroq harakatlanadi.

B. Teskari fazali xromatografiya

Bugungi kunda bu oltin standart hisoblanadi. Ehtimol, laboratoriyada qiladigan ishimning 90% teskari fazali xromatografiyani o'z ichiga oladi. Bu erda biz skriptni aylantiramiz. Ustun qutbsiz (moy kabi gidrofobik), fazali esa qutbli (odatda suv va metanol yoki asetonitril aralashmasi).

• Mantiq: Suvni yaxshi ko'radigan (qutbli) molekulalar yog'li ustundan nafratlangani uchun kattalashadi. Yog'ni yaxshi ko'radigan (polyar bo'lmagan) molekulalar elim kabi ustunga yopishadi.

• Nima uchun biz uni yaxshi ko'ramiz: Bu oldindan aytib bo'ladigan, ko'p qirrali va boshqarish osonroq bo'lgan suvga asoslangan erituvchilardan foydalanadi.

3. Erituvchi sifatining “oltin qoidasi”

Siz biron bir sababga ko'ra yorliqlarda "HPLC darajasi"ni ko'rasiz. ACS darajasi yoki undan kam narsadan foydalanish haqida o'ylamang. Nega? Chunki quyi gradusli erituvchilardagi bu “mayda” aralashmalar vaqt o‘tishi bilan sizning ustuningizda to‘planib, ruxsatingizni o‘ldiradi va g‘alati arvoh cho‘qqilarini hosil qiladi.

Har doim Milli-Q (18,2 MŌ.cm) navli suvdan foydalaning. Agar sizning suvingiz "iflos" bo'lsa, sizning asosiy chiziq tog 'tizmasiga o'xshaydi va siz uch kun davomida nima uchun ekanligini tushunishga harakat qilasiz.

4. Gazsizlantirish va filtrlash: ishlash qotillari

Havo hplc mobil fazasining dushmanidir. Oddiy bosim ostida havo sizning erituvchilaringizda eriydi. Ammo bu erituvchi nasosga tushgach, bu mayda pufakchalar nazorat klapanlari yoki detektor katakchasiga yopishib qolishi mumkin.

• Natija: oqim tezligining o'zgarishi, pulsatsiyalanuvchi asosiy chiziqlar va harakatni ushlab turish vaqtlari.

• Tuzatish: Agar yuqori sezuvchanlik tahlillarini o'tkazayotgan bo'lsangiz, o'rnatilgan degasserlardan yoki sonikatsiya\/vakuumli filtrlashdan foydalaning.

Filtrlash ixtiyoriy emas. Hatto HPLC darajasidagi erituvchilar ham ishlab chiqarish jarayonidan yoki shisha qopqog'idan mikroskopik zarralarga ega bo'lishi mumkin. Har doim 0,22 mkm yoki 0,45 µm membranani rezervuaringizga tegmasdan oldin filtrlang. Bu sizning ustuningizni erta o'limdan qutqarishi mumkin bo'lgan 5 daqiqalik vazifa.

5. Buferlar va shisha tuzoq

Teskari fazali xromatografiyada biz ionlashtiriladigan namunalar uchun pH ni barqaror saqlash uchun tamponlardan foydalanamiz.

• Maslahat: Agar siz bugun tampon ishlatgan bo'lsangiz, uyga ketishdan oldin tizimni toza suv bilan yuving. Agar shunday qilmasangiz, bu tuzlar kristallanadi va nasos muhrlarini parchalab tashlaydi.

• Shisha tuzoq: Agar hplc mobil fazasi pH > 8,0 bo'lsa, u shisha rezervuarlardan metall ionlarini yuvishi mumkinligini bilasizmi? Bunday hollarda zanglamaydigan po'latdan yoki maxsus plastik idishlarga o'ting.

Keling, ajralishingizni mukammal qilaylik

Mobil fazani to'g'ri olish HPLC-dagi jangning 80% ni tashkil qiladi. Agar siz "shag gilam" asoslari, bosimning keskin ko'tarilishi yoki nomuvofiq natijalar bilan kurashayotgan bo'lsangiz, taxmin qilish uchun yana bir kunni behuda sarflamang.

Men ushbu aniq muammolarni hal qilish uchun skameykada minglab soat sarfladim. Loyihangizni yo‘lga qo‘yish uchun “laboratoriyada tasdiqlangan” maslahatlar bilan bo‘lishishdan doim xursandman.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Email:boonemi@aijirenvial.com
  

Ma'lumotnomalar

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J. va Dolan, J. W. (2011). Zamonaviy suyuqlik xromatografiyasiga kirish. 3-nashr. Jon Wiley & Sons. (HPLC ajratish mexanizmlarini tushunish uchun "Oltin standart").

• Dolan, J. V. (2002). "Mobil fazaga tayyorgarlik." LCGC Shimoliy Amerika, muammolarni bartaraf etish seriyasi. (Degassatsiya va filtrlash bo'yicha muhim amaliy qo'llanma).

• Aparicio, R. (Tahr.). (2013). HPLC optimallashtirish bo'yicha qo'llanma. Elsevier. (Teskari fazali xromatografiyada erituvchining polaritesi va bufer tanlash bo'yicha keng qamrovli ma'lumotlar).

• Agilent Technologies. "HPLC tizimi nosozliklarini bartaraf etish bo'yicha qo'llanma: umumiy mobil faza xatolarining oldini olish." Texnik manbalar kutubxonasi.

• Waters korporatsiyasi. "Xromatografiya tamoyillari: normal faza va teskari faza". Ta'lim seriyasi.

• Uyg'unlashtirish bo'yicha xalqaro konferentsiya (ICH). Q2(R1) Analitik protseduralarni tekshirish: matn va metodologiya. (Yuqori hudud miqdorini aniqlash va saqlash vaqti barqarorligi uchun standart).