Làm chủ quy trình: Hướng dẫn dành cho cựu chiến binh trong phòng thí nghiệm về các pha di động HPLC

Giới thiệu

Tôi cũng giống như bạn—nhìn chằm chằm vào màn hình lúc 2 giờ sáng, xem đường cơ sở trôi dạt như một chiếc thuyền bị lạc trên biển, tự hỏi liệu "HPLC doo-hickey" có được phát minh ra chỉ để kiểm tra sự tỉnh táo của tôi hay không. Nếu bạn cảm thấy mê sảng khi cố gắng tập trung vào sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hãy hít một hơi. Nó không chỉ là một hộp đựng những bộ phận đắt tiền; đó là một điệu nhảy tinh tế giữa hóa học và vật lý.

Trong phòng thí nghiệm, chúng ta thường nói pha động là “đường sống” của hệ thống. Nếu không có nó, mẫu của bạn chỉ nằm trong một ống tiêm và không đi đến đâu. Nhưng làm thế nào để bạn chọn đúng "chuyến tàu" để vận chuyển các phân tử của mình đến máy dò? Hãy chia nhỏ nó ra như thể chúng ta đang trò chuyện bên tách cà phê trong phòng nghỉ.

1. HPLC thực sự là gì?

Về cốt lõi, HPLC là về sự phân tách. Hãy nghĩ về nó giống như một cuộc đua trong đó "đường đua" là pha đứng yên (cột) và "gió" đẩy người chạy dọc theo pha động hplc.

Điều kỳ diệu xảy ra vì các phân tử khác nhau có “ái lực” khác nhau. Một số phân tử thích pha động và phóng to qua cột. Những người khác thì “dính” – họ say mê pha tĩnh và tụt lại phía sau. Sự khác biệt về tốc độ này là nguyên nhân tạo ra những đỉnh đó trên sắc ký đồ của bạn.

2. Pha thường và pha ngược

Đây thường là lúc mọi người bắt đầu nhổ tóc. Trong nhiều năm thực hành, tôi đã tìm ra cách dễ nhất để ghi nhớ điều này là nhìn vào sự phân cực.

A. Sắc ký pha thông thường

Đây là cách "trường học cũ". Trong sắc ký pha thông thường, pha tĩnh là cực – hãy coi nó giống như nam châm hút các phân tử phân cực. Pha động chúng tôi sử dụng ở đây là không phân cực, thường là các dung môi như hexane hoặc heptan.

• Logic: Các phân tử "dính" ở cực bị cột cực giữ lại. Các phân tử không phân cực bị rửa trôi nhanh chóng với pha động không phân cực.

• Mẹo chuyên nghiệp: Nếu bạn tăng độ phân cực của pha động (thêm một chút isopropanol), mẫu của bạn sẽ thực sự di chuyển nhanh hơn.

B. Sắc ký pha đảo

Ngày nay, đây là tiêu chuẩn vàng. Có lẽ 90% công việc tôi làm trong phòng thí nghiệm liên quan đến sắc ký pha đảo. Ở đây, chúng tôi lật kịch bản. Cột không phân cực (kỵ nước, giống như dầu) và pha động là cực (thường là hỗn hợp nước và metanol hoặc axetonitril).

• Logic: Các phân tử ưa nước (cực) di chuyển qua vì chúng ghét cột dầu. Các phân tử ưa chất béo (không phân cực) dính vào cột như keo.

• Tại sao chúng tôi yêu thích nó: Nó có thể dự đoán được, linh hoạt và sử dụng dung môi gốc nước dễ quản lý hơn.

3. “Quy tắc vàng” về chất lượng dung môi

Bạn sẽ thấy "Cấp HPLC" trên nhãn là có lý do. Thậm chí đừng nghĩ đến việc sử dụng cấp độ ACS hoặc bất cứ thứ gì thấp hơn. Tại sao? Bởi vì những tạp chất "nhỏ" trong dung môi cấp thấp hơn sẽ tích tụ trên cột của bạn theo thời gian, làm mất đi độ phân giải của bạn và tạo ra các đỉnh ma quái kỳ lạ.

Luôn sử dụng nước cấp Milli-Q (18,2 MΩ.cm). Nếu nước của bạn "bẩn", đường cơ sở của bạn sẽ trông giống như một dãy núi và bạn sẽ mất ba ngày để tìm hiểu lý do.

4. Khử khí và lọc: Kẻ giết chết hiệu suất

Không khí là kẻ thù của pha di động hplc. Dưới áp suất bình thường, không khí hòa tan trong dung môi của bạn. Nhưng một khi dung môi đó chạm vào máy bơm, những bong bóng nhỏ đó có thể bị mắc kẹt trong các van kiểm tra hoặc tế bào dò.

• Kết quả: Tốc độ dòng chảy dao động, đường cơ sở dao động và thời gian lưu chuyển động.

• Cách khắc phục: Sử dụng bộ khử khí tích hợp hoặc lọc siêu âm\/chân không nếu bạn đang chạy các xét nghiệm có độ nhạy cao.

Lọc không phải là tùy chọn. Ngay cả dung môi loại HPLC cũng có thể có các hạt cực nhỏ từ quá trình sản xuất hoặc nắp chai. Luôn lọc qua màng 0,22µm hoặc 0,45µm trước khi chạm vào bể chứa của bạn. Đó là một nhiệm vụ kéo dài 5 phút có thể cứu chuyên mục của bạn khỏi cái chết sớm.

5. Bộ đệm và bẫy thủy tinh

Trong sắc ký pha đảo, chúng tôi sử dụng chất đệm để giữ độ pH ổn định cho các mẫu có thể bị ion hóa.

• Mẹo chuyên nghiệp: Nếu hôm nay bạn sử dụng bộ đệm, hãy rửa hệ thống bằng nước tinh khiết\/hỗn hợp hữu cơ trước khi về nhà. Nếu không, những muối đó sẽ kết tinh và làm hỏng phớt bơm của bạn.

• Bẫy thủy tinh: Bạn có biết rằng nếu pH pha động hplc của bạn > 8,0, nó thực sự có thể lọc các ion kim loại từ các bể chứa thủy tinh? Hãy chuyển sang dùng hộp đựng bằng thép không gỉ hoặc nhựa chuyên dụng trong những trường hợp này.

Hãy để cuộc chia ly của bạn được hoàn hảo

Thực hiện đúng pha di động là 80% của trận chiến trong HPLC. Nếu bạn đang gặp khó khăn với các đường cơ sở "thảm lông", áp lực tăng đột biến hoặc kết quả không nhất quán, đừng lãng phí thêm một ngày nữa để đoán mò.

Tôi đã dành hàng nghìn giờ ở ghế dự bị để khắc phục chính xác những vấn đề này. Tôi luôn sẵn lòng chia sẻ một chút lời khuyên "đã được chứng minh trong phòng thí nghiệm" để đưa dự án của bạn đi đúng hướng.

• WhatsApp: 86 18338832256

• Email:boonemi@aijirenvial.com
  

Tài liệu tham khảo

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Giới thiệu về sắc ký lỏng hiện đại. Phiên bản thứ 3. John Wiley & Con trai. ("Tiêu chuẩn vàng" để hiểu cơ chế tách HPLC).

• Dolan, J. W. (2002). "Chuẩn bị pha di động." LCGC Bắc Mỹ, Chuỗi sự cố. (Hướng dẫn thực hành cần thiết để khử khí và lọc).

• Aparicio, R. (Ed.). (2013). Hướng dẫn tối ưu hóa HPLC. Khác. (Dữ liệu toàn diện về độ phân cực của dung môi và lựa chọn dung dịch đệm trong sắc ký pha đảo).

• Công nghệ Agilent. "Hướng dẫn khắc phục sự cố hệ thống HPLC: Tránh các lỗi pha di động thường gặp." Thư viện tài nguyên kỹ thuật.

• Công ty cổ phần Waters. "Nguyên tắc sắc ký: Pha thường và pha ngược." Chuỗi giáo dục.

• Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa (ICH). Q2(R1) Xác nhận quy trình phân tích: Văn bản và phương pháp luận. (Tiêu chuẩn để định lượng diện tích pic và độ ổn định thời gian lưu).