バッファーは、少量の酸または塩基を追加した後、pHが変化しない溶液です。組成に基づいて、バッファーは酸性または塩基性のいずれかに分類できます。バッファーの有効性は、そのPKAによって決定されます。これは、理想的には、最適なバッファリング能力のために、目的の移動相pHの±1 pH単位内でなければなりません。
考慮すべき重要な要因
1.PH範囲：移動相のpHは、分析物のPKAから少なくとも2つのpHユニットを離れている必要があります。これにより、酸性または塩基性分析物のイオン化を抑制し、カラムでの保持を最大化するのに役立ちます。たとえば、分析物が4.5のPKAを持つ弱酸である場合、pHを約2.0の移動相を使用すると、それを非固定状態に保ち、保持を強化します。
2.バッファタイプ：HPLCで使用される一般的なバッファーには以下が含まれます。
リン酸緩衝液：2.0〜8.0のpH範囲で有効なリン酸緩衝液は、多くの分析物との安定性と互換性のために広く使用されています。これらは、LC-UVアプリケーションに特に適しています。
酢酸緩衝液：これらはLC-UVアッセイにも人気があり、リン酸緩衝液と同様のpH範囲で使用できます。
揮発性緩衝液：LC-MSアプリケーションの場合、質量分析プロセス中に簡単に除去できるため、フォーミ酸塩、酢酸、重炭酸アンモニウムなどの揮発性緩衝液が好まれます。
3.バッファ濃度：HPLCの緩衝液の典型的な開始濃度は25〜50 mmです。濃度が高いほど、ピークの形状と効率が向上する可能性がありますが、有機溶媒と混合すると降水につながる可能性があります。合併症を避けるために、バッファー濃度を25 mm未満に保つことをお勧めします。
4.化学的純度：常に高度のクロマトグラフグレードバッファーを使用して、汚染を防ぎ、信頼できる結果を確保してください。不純物は、保持時間の予期しない相互作用と変動につながる可能性があります。
温度効果：温度は、バッファー溶液のpHに影響を与える可能性があります。バッファーを一貫した温度で準備して保管して、その効果を維持することが重要です。
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バッファー準備のための実用的なヒント
調製方法：バッファーは、等モル量の酸性成分と塩基性成分を混合するか、酸と酸性溶液を滴定することで調製できます。有機溶媒を追加した後、pHを調整しないでください。これは一貫性のない結果につながる可能性があるためです。
新鮮なソリューション：クロマトグラフィーのパフォーマンスに影響を与える可能性のある成分の微生物の成長と分解を最小限に抑えるために、定期的に新鮮なバッファーソリューションを準備します。
腐食の回避：クエン酸塩などの特定のバッファーは、HPLCシステムのステンレス鋼成分を腐食させる可能性があります。そのようなバッファーを使用して損傷を防ぐと、システムの徹底的なフラッシングを確認してください。
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